Evoluție ghidată

Evoluție dirijată ( ED ) este o metodă utilizată în ingineria proteinelor care imita procesul de selecție naturală la „directă“ , a evoluția a proteinelor sau a acizilor nucleici la o țintă definit de către utilizator. Această metodă constă în supunerea unei gene unor cicluri iterative de mutageneză (care creează o bibliotecă de variante), de selecție (care face posibilă exprimarea variantelor și izolarea membrilor care posedă funcția pe care o căutăm) și „ amplificare (care generează un model pentru ciclul următor). Poate fi implementat in vivo (în celule vii), sau in vitro (celule libere în soluție sau în microgocuri ). Evoluția dirijată este utilizată atât în ​​ingineria proteinelor ca alternativă la proiectarea rațională a proteinelor modificate, cât și în studiile principiilor evolutive fundamentale într-un mediu controlat de laborator.

Principii

Evoluția dirijată este o imitație a ciclului natural al evoluției ca parte a unui cadru de laborator. Evoluția necesită trei lucruri: să existe o variație ( diversitate genetică ) între replici, că această variație provoacă diferențe în starea de fitness asupra căreia acționează selecția și, în cele din urmă, că această variație este ereditară . În ED, o singură genă suferă procesul de evoluție prin cicluri iterative de mutageneză, selecție sau screening și amplificare. De obicei, ciclurile acestor pași se repetă, folosind cea mai bună variantă dintr-un ciclu ca șablon pentru următorul, pentru a îmbunătăți procesul pas cu pas.

Probabilitatea de succes într-un experiment evolutiv direcționat este direct legată de dimensiunea totală a bibliotecii, deoarece luarea în considerare a mai multor mutanți crește șansele de a găsi unul cu proprietățile de interes.

Generați diversitate

Primul pas în realizarea unui ciclu de ED este crearea unei biblioteci de gene genetice. Spațiul secvențial al unei secvențe aleatorii este mare (10 130 de secvențe posibile pentru o proteină de 100 de aminoacizi ) și extrem de puțin populat de proteine ​​funcționale. Nici evoluția experimentală, nici cea naturală nu pot fi aproape de a putea prelua atât de multe secvențe. Desigur, evoluția naturală eșantionează variante de secvențe apropiate de secvențele proteice funcționale, iar acest lucru este limitat în DE prin mutageneza unei gene deja funcționale. Unele calcule sugerează că acest lucru este pe deplin fezabil pentru toate scopurile practice (funcționale și structurale), deoarece spațiul secvențial proteic a fost explorat pe deplin în timpul evoluției vieții pe Pământ.

Gena inițială poate fi mutagenizată prin mutații punctuale (folosind mutageni chimici sau PCR predispuse la erori), precum și prin inserții și deleții (folosind transpozoni ). ADN recombinant poate fi imitat printr - o amestecarea ADN din mai multe secvențe ( în mod tipic mai mult de 70% omologie ) pentru a sări în zonele spațiale secvențiale dintre genele părinte reprelucrate. În cele din urmă, regiunile specifice unei gene pot fi randomizate sistematic (suferă mutageneză aleatorie) pentru o abordare mai direcționată bazată pe cunoașterea structurii și funcției. În funcție de metoda utilizată, proporția variantelor funcționale va varia de la o bibliotecă la alta. Chiar dacă un organism este folosit pentru a exprima o genă de interes, dacă numai acea genă suferă mutageneză, restul genomului organismului va rămâne același și poate fi ignorat pentru experiment (atâta timp cât se păstrează un mediu genetic constant).

Detectați diferențele de fitness

Majoritatea mutațiilor sunt dăunătoare și, prin urmare, băncile mutanților tind să aibă în principal variante cu activitate redusă. Astfel, analiza de mare randament este vitală pentru măsurarea activității pentru a găsi variantele rare care au mutații benefice care sporesc proprietățile dorite. Există două categorii principale de metode pentru izolarea variantelor funcționale. Sistemele de selecție cuplează direct funcția proteinei cu supraviețuirea genei, în timp ce sistemele de screening analizează fiecare variantă individual și stabilesc un prag cantitativ pentru a izola o variantă sau o populație de variante ale activității dorite. Atât selecția, cât și screeningul pot fi efectuate în celule vii (evoluție in vivo ) sau direct pe proteină sau ARN fără ca aceasta să fie în interiorul celulelor (evoluție in vitro ).

În timpul evoluției in vivo , fiecare celulă (de obicei în bacterii sau drojdie ) este transformată cu o plasmidă care conține un membru diferit al bibliotecii de variante. În această metodă, doar gena de interes diferă între celule, toate celelalte gene rămânând aceleași. Celulele exprimă proteina fie în citoplasma lor, fie pe suprafața lor, unde funcția lor poate fi testată. Acest format are avantajul de a selecta proprietăți într-un mediu celular, care este util atunci când proteina sau ARN-ul evoluat este utilizat în organismele vii. În metoda fără celule, DE implică utilizarea transcrierii in vitro -traducere pentru a produce proteine ​​libere sau ARN (uri) în soluție sau compartimentate în microgocuri artificiale. Această metodă are avantajul că este mai versatilă în condițiile de selecție (de exemplu , temperatură , solvent ) și poate exprima proteine ​​care pot fi toxice pentru celule. În plus, experimentele de evoluție in vitro pot genera biblioteci mult mai mari (până la 10 15 ), deoarece biblioteca ADN nu trebuie să fie inserată în celule (ceea ce este adesea un pas care limitează).

Selecţie

Selectarea activității de legare este simplă din punct de vedere conceptual. Molecula țintă este imobilizată pe un suport solid, o bibliotecă de proteine ​​variante este aruncată pe acest suport, cele care se leagă slab sunt spălate și variantele de legare rămase sunt recuperate pentru a-și izola genele. Legarea unei enzime la un inhibitor covalent imobilizat a fost, de asemenea, utilizată în încercarea de a izola catalizatorii activi. Cu toate acestea, această abordare selectează doar o singură rotație catalitică și nu este un model bun de legare a substratului sau o bună reactivitate a substratului. Dacă activitatea enzimatică poate fi necesară pentru supraviețuirea celulei, fie prin sinteza unui metabolit vital , fie prin distrugerea unei toxine , atunci supraviețuirea celulei depinde de activitatea enzimatică. Astfel de sisteme sunt în general limitate ca rată doar prin transformarea eficientă a celulelor. Ele sunt, de asemenea, mai puțin costisitoare și consumatoare de forță de muncă decât screening-ul, totuși sunt de obicei dificil de proiectat, predispuse la artefacte și nu oferă informații despre gama de activități prezente în bancă.

Screening

O alternativă la screening este sistemul de screening. Fiecare genă variantă este exprimată individual și analizată pentru a măsura cantitativ activitatea (cel mai adesea folosind un indicator colorat sau un fluorocrom ). Variantele sunt apoi clasificate și experimentatorul decide ce variante să utilizeze ca modele pentru următorul ciclu de evoluție direcționată. Chiar și analizele cu cel mai mare randament au o acoperire mai restrânsă decât metodele de selecție, dar au avantajul de a oferi informații detaliate despre fiecare dintre variantele detectate. Aceste date dezagregate pot fi folosite și pentru a caracteriza distribuția activităților în bănci, ceea ce nu este posibil în sistemele de selecție simple. Astfel, sistemele de ecranare aduc avantaje clare atunci când vine vorba de caracterizarea evoluției adaptative din punct de vedere experimental și a peisajelor adaptative .

Asigurați ereditatea

Când proteinele funcționale au fost izolate, la fel trebuie să fie și genele lor; de aceea, este necesară o legătură genotip - fenotip . Această legătură poate fi covalentă, ca și în mARN-ul în care gena mARN-ului afișat este legată de proteină de puromicină la sfârșitul traducerii . În caz contrar, proteina și gena acesteia pot fi co-localizate prin compartimentare în celule vii sau în picături de emulsie. Secvențele genetice izolate sunt apoi amplificate prin PCR sau prin bacterii gazdă transformate. Fie cea mai bună secvență, fie un grup de secvențe pot fi utilizate ca șabloane pentru următoarea rundă de mutageneză. Ciclurile repetate de diversificare-selecție-amplificare generează variante de proteine ​​adaptate presiunilor de selecție aplicate.

Comparație cu proiectarea rațională a proteinelor

Beneficiile evoluției dirijate

Proiectarea rațională a unei proteine ​​se bazează pe o cunoaștere aprofundată a structurii acestei proteine, precum și a mecanismului său catalitic . Modificări specifice sunt apoi făcute prin mutageneză direcționată către sit, pentru a schimba funcția proteinei. Dezavantajul este că, chiar și atunci când structura și mecanismul de acțiune al proteinei sunt bine cunoscute, schimbarea datorată mutației este încă dificil de prezis. Astfel, un avantaj al ED este că nu este nevoie să înțelegem mecanismul activității dorite sau cum ar afecta mutațiile.

Limitele evoluției dirijate

O restricție a DE este că este necesară o analiză de mare randament pentru a măsura efectele unui număr mare de mutații aleatorii diferite. Este posibil să fie necesare cercetări și dezvoltări extinse înainte de a putea fi utilizate pentru DE. În plus, astfel de analize sunt adesea foarte specifice observării unei anumite activități și, prin urmare, nu sunt transferabile noilor experiențe DE.

În plus, selectarea unei îmbunătățiri a funcției analizate generează pur și simplu îmbunătățiri în acea funcție. Pentru a înțelege cum se realizează aceste îmbunătățiri, trebuie măsurate proprietățile enzimei în evoluție. O îmbunătățire a activității analizate se poate datora îmbunătățirilor activității catalitice a enzimei sau a concentrației acestei enzime. De asemenea, nu oferă o garanție că îmbunătățirea unui substrat va îmbunătăți activitatea în altul. Acest lucru este deosebit de important atunci când activitatea dorită nu poate fi detectată sau selectată direct și, prin urmare, este utilizat un substrat „ proxy ”. DE poate duce la specializarea proxy scalabilă fără a spori activitatea dorită. Prin urmare, alegerea unui screening adecvat sau a condițiilor de screening este vitală pentru o DE de succes.

Abordări combinatorii

Cercetătorii studiază abordări combinate „semi-raționale” pentru a aborda limitările proiectării raționale și a evoluției direcționate. Mutațiile benefice sunt rare și, prin urmare, un număr mare de mutanți aleatori trebuie examinați pentru variante îmbunătățite. „Bibliotecile direcționate” se concentrează pe regiunile randomizate despre care se presupune că sunt mai bogate în mutații benefice pentru etapa de mutageneză ED. O bibliotecă vizată conține mai puține variante decât o bibliotecă tradițională mutantă aleatorie și, prin urmare, nu are nevoie de o analiză atât de mare.

Faptul de a crea o bibliotecă vizată necesită o anumită cunoaștere a reziduurilor care trebuie mutate în structură; de exemplu, cunoașterea sitului activ al unei enzime poate permite doar reziduurile cunoscute care interacționează cu substratul să fie randomizate. În caz contrar, cunoașterea regiunilor proteice variabile în natură poate ghida mutageneza numai în acele regiuni.

Utilizări

Evoluția dirijată este frecvent utilizată în ingineria proteinelor ca alternativă la proiectarea rațională, dar poate fi folosită și pentru studierea problemelor fundamentale ale evoluției enzimei.

Ingineria proteinelor

Ca instrument de inginerie proteică, DE a avut cel mai mare succes în trei domenii:

  1. Îmbunătățiți stabilitatea proteinelor pentru utilizare biotehnologică , la temperaturi ridicate sau în solvenți puternici;
  2. Îmbunătățirea afinității de legare a anticorpilor terapeutici (maturizarea afinității) și a activității enzimelor modificate de novo  ;
  3. Modificați specificitatea substratului enzimelor existente (deseori destinate utilizării în industrie).

Studii evolutive

Studiul evoluției naturale se bazează în mod tradițional pe organisme care există și astăzi și pe genele lor. Cu toate acestea, cercetarea este fundamental limitată de lipsa fosilelor (și în special de lipsa secvențelor de ADN fosil ) și de cunoașterea incompletă a condițiilor de mediu antice. Evoluția direcționată discută evoluția într-un sistem controlat de gene individuale care codifică enzime, ribozime și replicatoare (vezi teoria genică egoistă a lui Richard Dawkins ), similar evoluției experimentale a eucariotelor , procariotelor și virușilor .

ED ajută la controlul presiunii de selecție, a mutației și a mediului (atât din punct de vedere al factorilor abiotici, cum ar fi temperatura, cât și al factorilor biotici, precum alte gene din corp). În plus, există un fișier complet care enumeră toate genele evolutive intermediare. Acest lucru permite măsurări detaliate ale proceselor evolutive, de exemplu epistază , evolutivitate , peisaje adaptive constrânse în adaptare și rețele neutre .

Vezi și tu

Note

Referințe

  1. Ștefan Lutz , „  Dincolo de regia evolutie - proteine de inginerie semi-rațională și design  “, Current Opinion in Biotehnologie , vol.  21, nr .  6,decembrie 2010, p.  734–743 ( ISSN  1879-0429 , PMID  20869867 , PMCID  PMC2982887 , DOI  10.1016 / j.copbio.2010.08.011 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  2. CA Voigt , S. Kauffman și ZG Wang , „  Rational evolutionary design: the theory of in vitro protein protein  ”, Advances in Protein Chemistry , vol.  55,2000, p.  79–160 ( ISSN  0065-3233 , PMID  11050933 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  3. Paul A. Dalby , „  Strategie și succes pentru evoluția dirijată a enzimelor  ”, Opinia curentă în biologie structurală , vol.  21, nr .  4,august 2011, p.  473–480 ( ISSN  1879-033X , PMID  21684150 , DOI  10.1016 / j.sbi.2011.05.003 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  4. Dasa Lipovsek și Andreas Plückthun , „  In-vitro protein protein by display ribozom and display mRNA  ”, Journal of Immunological Methods , vol.  290, nr .  1-2,Iulie 2004, p.  51–67 ( ISSN  0022-1759 , PMID  15261571 , DOI  10.1016 / j.jim.2004.04.008 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  5. David TF Dryden , Andrew R. Thomson și John H. White , „  Cât din spațiul secvenței de proteine ​​a fost explorat de viața de pe Pământ?  ”, Journal of the Royal Society, Interface , vol.  5, n o  25,6 august 2008, p.  953–956 ( ISSN  1742-5689 , PMID  18426772 , PMCID  PMC2459213 , DOI  10.1098 / rsif.2008.0085 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  6. O. Kuchner și FH Arnold , „  Evoluția dirijată a catalizatorilor enzimatici  ”, Tendințe în biotehnologie , vol.  15, n o  12,Decembrie 1997, p.  523–530 ( ISSN  0167-7799 , PMID  9418307 , DOI  10.1016 / S0167-7799 (97) 01138-4 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  7. S. Sen , V. Venkata Dasu și B. Mandal , „  Dezvoltări în evoluția direcționată pentru îmbunătățirea funcțiilor enzimatice  ”, Biochimie aplicată și biotehnologie , vol.  143, nr .  3,decembrie 2007, p.  212–223 ( ISSN  0273-2289 , PMID  18057449 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  8. D. Dafydd Jones , „  Îndepărtarea tripletelor de nucleotide în poziții aleatorii într-o genă țintă: toleranța beta-lactamazei TEM-1 la o deleție a aminoacizilor  ”, Cercetarea acizilor nucleici , vol.  33, nr .  9,16 mai 2005, e80 ( ISSN  1362-4962 , PMID  15897323 , PMCID  PMC1129029 , DOI  10.1093 / nar / gni077 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  9. WP Stemmer , „  Evoluția rapidă a unei proteine ​​in vitro prin amestecarea ADN-ului  ”, Nature , vol.  370, nr .  6488,4 august 1994, p.  389–391 ( ISSN  0028-0836 , PMID  8047147 , DOI  10.1038 / 370389a0 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  10. A. Crameri , SA Raillard , E. Bermudez și WP Stemmer , „  ADN amestecarea unei familii de gene din diverse specii accelerează evoluția direcționată  ”, Nature , vol.  391, nr .  6664,15 ianuarie 1998, p.  288–291 ( ISSN  0028-0836 , PMID  9440693 , DOI  10.1038 / 34663 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  11. Manfred T. Reetz și José Daniel Carballeira , „  Mutageneză de saturație iterativă (ISM) pentru evoluția rapidă direcționată a enzimelor funcționale  ”, Nature Protocols , vol.  2, n o  4,2007, p.  891–903 ( ISSN  1750-2799 , PMID  17446890 , DOI  10.1038 / nprot.2007.72 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  12. Daniel L. Hartl , „  Ce putem învăța din peisajele de fitness?  ”, Opinia curentă în microbiologie , vol.  21,octombrie 2014, p.  51–57 ( ISSN  1879-0364 , PMID  25444121 , PMCID  PMC4254422 , DOI  10.1016 / j.mib.2014.08.001 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  13. Ahmed H. Badran și David R. Liu , „  In vivo continued evolution evolution  ”, Current Opinion in Chemical Biology , vol.  24,februarie 2015, p.  1-10 ( ISSN  1879-0402 , PMID  25461718 , PMCID  PMC4308500 , DOI  10.1016 / j.cbpa.2014.09.040 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  14. Ashwani Kumar și Suren Singh , „  Evoluția dirijată: adaptarea biocatalizatorilor pentru aplicații industriale  ”, Critical Reviews in Biotechnology , vol.  33, nr .  4,Decembrie 2013, p.  365–378 ( ISSN  1549-7801 , PMID  22985113 , DOI  10.3109 / 07388551.2012.716810 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  15. William GT Willats , „  Afișarea fagilor: aspecte practice și perspective  ”, Plant Molecular Biology , vol.  50, n o  6,decembrie 2002, p.  837–854 ( ISSN  0167-4412 , PMID  12516857 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  16. Hans Leemhuis , Viktor Stein , Andrew D. Griffiths și Florian Hollfelder , „  Noi legături genotip-fenotip pentru evoluția direcționată a proteinelor funcționale  ”, Opinia curentă în Structural Biology , vol.  15, n o  4,August 2005, p.  472–478 ( ISSN  0959-440X , PMID  16043338 , DOI  10.1016 / j.sbi.2005.07.006 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  17. Kathryn D. Verhoeven , Olvia C. Altstadt și Sergey N. Savinov , „  Detecția intracelulară și evoluția proteazelor site-specific folosind un sistem de selecție genetică  ”, Biochimie și biotehnologie aplicată , vol.  166, nr .  5,martie 2012, p.  1340–1354 ( ISSN  1559-0291 , PMID  22270548 , DOI  10.1007 / s12010-011-9522-6 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  18. Annalee W. Nguyen și Patrick S. Daugherty , „  Optimization evolutiv al proteinelor fluorescente pentru FRET intracelular  ”, Nature Biotechnology , vol.  23, n o  3,Martie 2005, p.  355–360 ( ISSN  1087-0156 , PMID  15696158 , DOI  10.1038 / nbt1066 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  19. Yolanda Schaerli și Florian Hollfelder , „  Potențialul picăturilor microfluidice de apă în ulei în biologia experimentală  ”, Molecular bioSystems , vol.  5, n o  12,decembrie 2009, p.  1392–1404 ( ISSN  1742-2051 , PMID  20023716 , DOI  10.1039 / b907578j , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  20. Shannon A. Marshall , Greg A. Lazar , Arthur J. Chirino și John R. Desjarlais , „  Proiectarea rațională și ingineria proteinelor terapeutice  ”, Drug Discovery Today , vol.  8, n o  5,1 st martie 2003, p.  212–221 ( ISSN  1359-6446 , PMID  12634013 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  21. Corey J. Wilson , „  Proiectarea rațională a proteinelor: dezvoltarea următoarei generații de terapii biologice și instrumente nanobiotecnologice  ”, Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicină și Nanobiotecnologie , vol.  7, n o  3,Mai 2015, p.  330–341 ( ISSN  1939-0041 , PMID  25348497 , DOI  10.1002 / wnan.1310 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  22. Lars Giger , Sami Caner , Richard Obexer și Peter Kast , „  Evoluția unei retro-aldolaze proiectate duce la remodelarea completă a sitului activ  ”, Nature Chemical Biology , vol.  9, n o  8,August 2013, p.  494–498 ( ISSN  1552-4469 , PMID  23748672 , PMCID  PMC3720730 , DOI  10.1038 / nchembio.1276 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  23. UT Bornscheuer și M. Pohl , „  Biocatalizatori îmbunătățiți prin evoluție direcționată și proiectarea rațională a proteinelor  ”, Opinia curentă în chimia biologică , vol.  5, n o  2Aprilie 2001, p.  137–143 ( ISSN  1367-5931 , PMID  11282339 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  24. Moshe Goldsmith și Dan S. Tawfik , „  Evoluția enzimei direcționate: dincolo de fructele slab agățate  ”, Opinia curentă în biologie structurală , vol.  22, nr .  4,August 2012, p.  406-412 ( ISSN  1879-033X , PMID  22579412 , DOI  10.1016 / j.sbi.2012.03.010 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  26. Carlos G. Acevedo-Rocha , Sabrina Hoebenreich și Manfred T. Reetz , „  Mutageneză de saturație iterativă: o abordare puternică a ingineriei proteinelor prin simularea sistematică a evoluției darwiniene  ”, Methods in Molecular Biology (Clifton, NJ) , vol.  1179,2014, p.  103–128 ( ISSN  1940-6029 , PMID  25055773 , DOI  10.1007 / 978-1-4939-1053-3_7 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  27. Helge Jochens și Uwe T. Bornscheuer , „  Diversitatea naturală pentru a ghida evoluția direcționată  ”, Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology , vol.  11, n o  13,3 septembrie 2010, p.  1861–1866 ( ISSN  1439-7633 , PMID  20680978 , DOI  10.1002 / cbic.201000284 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  28. Helge Jochens , Dirk Aerts și Uwe T. Bornscheuer , „  Thermostabilization of an esterase by alignment-guided focussed focled evolution  ”, Ingineria proteinelor, proiectarea și selecția: PEDS , vol.  23, n o  12,decembrie 2010, p.  903–909 ( ISSN  1741-0134 , PMID  20947674 , DOI  10.1093 / protein / gzq071 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  29. Nicholas J. Turner , „  unități de evoluție dirijată următoarea generație de biocatalizatori  “, Nature Chemical Biology , vol.  5, n o  8,august 2009, p.  567-573 ( ISSN  1552-4469 , PMID  19620998 , DOI  10.1038 / nchembio.203 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  30. Philip A. Romero și Frances H. Arnold , „  Explorarea peisajelor de fitness proteic prin evoluție direcționată  ”, Nature Reviews. Biologie celulară moleculară , vol.  10, n o  12,decembrie 2009, p.  866–876 ( ISSN  1471-0080 , PMID  19935669 , PMCID  PMC2997618 , DOI  10.1038 / nrm2805 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  31. Pietro Gatti-Lafranconi , Antonino Natalello , Sascha Rehm și Silvia Maria Doglia , „  Evoluția stabilității într-o enzimă activă la rece determină relaxarea specificității și evidențiază efectele legate de substrat asupra adaptării la temperatură  ”, Journal of Molecular Biology , vol.  395, nr .  1,8 ianuarie 2010, p.  155–166 ( ISSN  1089-8638 , PMID  19850050 , DOI  10.1016 / j.jmb.2009.10.026 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  32. H. Zhao și FH Arnold , „  Evoluția direcționată transformă subtilizina E într-un echivalent funcțional al termitazei  ”, Protein Engineering , vol.  12, n o  1,Ianuarie 1999, p.  47–53 ( ISSN  0269-2139 , PMID  10065710 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  33. RE Hawkins , SJ Russell și G. Winter , „  Selecția anticorpilor fagici prin afinitate de legare. Mimicarea maturității afinității  ”, Journal of Molecular Biology , vol.  226, nr .  3,5 august 1992, p.  889–896 ( ISSN  0022-2836 , PMID  1507232 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  34. Fathima Aidha Shaikh și Stephen G. Withers , „  Predarea enzimelor vechi noi trucuri: inginerie și evoluție a glicozidazelor și glicozil transferazelor pentru sinteza îmbunătățită a glicozidelor  ”, Biochimie și biologie celulară = Biochimie Et Biologie Cellulaire , vol.  86, n o  2Aprilie 2008, p.  169–177 ( ISSN  0829-8211 , PMID  18443630 , DOI  10.1139 / O07-149 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  35. Manoj Cheriyan , Matthew J. Walters , Brian D. Kang și Laura L. Anzaldi , „  Evoluția dirijată a unei pirolate aldolaze pentru a recunoaște un substrat acil cu lanț lung  ”, Bioorganic & Medicinal Chemistry , vol.  19, n o  21,1 st noiembrie 2011, p.  6447-6453 ( ISSN  1464-3391 , PMID  21944547 , PMCID  PMC3209416 , DOI  10.1016 / j.bmc.2011.08.056 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  36. G. MacBeath , P. Kast și D. Hilvert , „  Redesigning enzimă topologie prin direcționat evoluție  ”, Știință (New York, NY) , vol.  279, nr .  5358,20 martie 1998, p.  1958–1961 ( ISSN  0036-8075 , PMID  9506949 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  37. Miguel D. Toscano , Kenneth J. Woycechowsky și Donald Hilvert , „  Redesign minimalist al site-ului activ: predarea enzimelor vechi noi trucuri  ”, Angewandte Chemie (Ed. Internațională în engleză) , vol.  46, nr .  18,2007, p.  3212–3236 ( ISSN  1433-7851 , PMID  17450624 , DOI  10.1002 / anie.200604205 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  38. Svante Pääbo , Hendrik Poinar , David Serre și Viviane Jaenicke-Despres , „  Analize genetice din ADN-ul antic  ”, Revista anuală a geneticii , vol.  38,2004, p.  645–679 ( ISSN  0066-4197 , PMID  15568989 , DOI  10.1146 / annurev.genet.37.110801.143214 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  39. M. Höss , P. Jaruga , TH Zastawny și M. Dizdaroglu , „  Deteriorarea ADN și recuperarea secvenței ADN din țesuturile antice  ”, Cercetarea acizilor nucleici , vol.  24, n o  7,1 st aprilie 1996, p.  1304–1307 ( ISSN  0305-1048 , PMID  8614634 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  40. Jesse D. Bloom și Frances H. Arnold , „  În lumina evoluției direcționate: căi ale evoluției adaptive a proteinelor  ”, Proceedings of the National Academy of Sciences din Statele Unite ale Americii , vol.  106 Supliment 1,16 iunie 2009, p.  9995–10000 ( ISSN  1091-6490 , PMID  19528653 , PMCID  PMC2702793 , DOI  10.1073 / pnas.0901522106 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  41. Alan M. Moses și Alan R. Davidson , „  In vitro evolution merge deep,  ” Proceedings of the National Academy of Sciences din Statele Unite ale Americii , vol.  108, nr .  20,17 mai 2011, p.  8071–8072 ( ISSN  1091-6490 , PMID  21551096 , PMCID  PMC3100951 , DOI  10.1073 / pnas.1104843108 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  42. K. Salehi-Ashtiani și JW Szostak , „  Evoluția in vitro sugerează multiple origini pentru ribozima cap de ciocan  ”, Nature , vol.  414, nr .  6859,1 st noiembrie 2001, p.  82–84 ( ISSN  0028-0836 , PMID  11689947 , DOI  10.1038 / 35102081 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  43. M. Sumper și R. Luce , „  Dovezi pentru producerea de novo a structurilor de ARN auto-replicante și adaptate mediului de către bacteriofag Qbeta replicaza  ”, Proceedings of the National Academy of Sciences din Statele Unite ale Americii , vol.  72, nr .  1,ianuarie 1975, p.  162–166 ( ISSN  0027-8424 , PMID  1054493 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  44. DR Mills , RL Peterson și S. Spiegelman , „  Un experiment darwinian extracelular cu o moleculă de acid nucleic autoduplicabilă  ”, Proceedings of the National Academy of Sciences din Statele Unite ale Americii , vol.  58, nr .  1,Iulie 1967, p.  217–224 ( ISSN  0027-8424 , PMID  5231602 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  45. JH Marden , MR Wolf și KE Weber , „  Performanța aeriană a Drosophila melanogaster din populațiile selectate pentru capacitatea de zbor în direcția vântului în sus  ”, The Journal of Experimental Biology , vol.  200, n o  Pt 21,Noiembrie 1997, p.  2747–2755 ( ISSN  0022-0949 , PMID  9418031 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  46. William C. Ratcliff , R. Ford Denison , Mark Borrello și Michael Travisano , „  Evoluția experimentală a multicelularității  ”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America , vol.  109, nr .  5,31 ianuarie 2012, p.  1595–1600 ( ISSN  1091-6490 , PMID  22307617 , PMCID  PMC3277146 , DOI  10.1073 / pnas.1115323109 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  47. Jeffrey E. Barrick , Dong Su Yu , Sung Ho Yoon și Haeyoung Jeong , „  Evoluția și adaptarea genomului într-un experiment pe termen lung cu Escherichia coli  ”, Nature , vol.  461, nr .  7268,29 octombrie 2009, p.  1243–1247 ( ISSN  1476-4687 , PMID  19838166 , DOI  10.1038 / nature08480 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  48. Richard H. Heineman , Ian J. Molineux și James J. Bull , „  Robustețea evolutivă a unui fenotip optim: re-evoluția lizei într-un bacteriofag șters pentru gena sa de lizină  ”, Journal of Molecular Evolution , vol.  61, n o  2August 2005, p.  181–191 ( ISSN  0022-2844 , PMID  16096681 , DOI  10.1007 / s00239-004-0304-4 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  49. Takuyo Aita , Norio Hamamatsu , Yukiko Nomiya și Hidefumi Uchiyama , „  Surveying a fitness local peisaj al unei proteine ​​cu site-uri epistatice pentru studiul evoluției dirijate  ”, Biopolymers , vol.  64, n o  25 iulie 2002, p.  95–105 ( ISSN  0006-3525 , PMID  11979520 , DOI  10.1002 / bip.10126 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  50. Barrett Steinberg și Marc Ostermeier , „  Schimbările de mediu acoperă văile evolutive  ”, Science Advances , vol.  2, n o  1,ianuarie 2016, e1500921 ( ISSN  2375-2548 , PMID  26844293 , PMCID  PMC4737206 , DOI  10.1126 / sciadv.1500921 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  51. FH Arnold , PL Wintrode , K. Miyazaki și A. Gershenson , „  Cum s-au adaptat enzimele: lecții din evoluția dirijată  ”, Tendințe în științe biochimice , vol.  26, n o  2Februarie 2001, p.  100–106 ( ISSN  0968-0004 , PMID  11166567 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )
  52. Jesse D. Bloom , Alpan Raval și Claus O. Wilke , „  Termodinamica evoluției proteinelor neutre  ”, Genetica , vol.  175, nr .  1,ianuarie 2007, p.  255–266 ( ISSN  0016-6731 , PMID  17110496 , PMCID  PMC1775007 , DOI  10.1534 / genetics.106.061754 , citit online , accesat la 28 noiembrie 2017 )

linkuri externe