Stabilizarea plasmidelor

Cele Plasmidele sunt elemente ale ADN - ului în general circular și dublu catenară. Acestea se găsesc în multe bacterii pe lângă genomul bacterian de bază. Prezența lor nu este necesară a priori pentru supraviețuirea celulei lor gazdă, deși pot avea gene care codifică funcții, oferind avantaje evolutive, cum ar fi exploatarea unei resurse a mediului, sinteza unui element. Esențial nedisponibil în mediu sau rezistență la o otravă. Dacă nu este cazul, plasmidele reprezintă o greutate moartă datorită utilizării resurselor celulare. Într-adevăr, ele sunt reproduse și genele lor sunt exprimate în detrimentul parțial al replicării și exprimării genomului propriu al celulei. În absența unui factor de selecție pentru prezența plasmidei, o celulă fiică care nu ar primi o copie a unei plasmide în timpul diviziunii celulei sale mamă ar fi, prin urmare, favorizată în cadrul populației .

În ceea ce privește bacteriile , se observă că majoritatea conțin una sau mai multe plasmide în stare sălbatică chiar și în absența oricărui factor de mediu favorabil menținerii lor. Această menținere (sau stabilizare) a unei plasmide într-o populație exploatează, prin urmare, alte principii.

Replicarea unei plasmide este efectuată de mașinile celulare, dar originea replicării și anumiți factori de replicare sunt specifici plasmidei. Numărul de copii ale plasmidei este astfel definit de plasmida însăși. Prin urmare, un sistem simplu de stabilizare constă în creșterea numărului de copii, astfel încât distribuția lor aleatorie face posibilă găsirea lor în fiecare celulă fiică după divizare. Într-adevăr, probabilitatea ca o celulă să se regăsească fără o copie a plasmidei este 2 -n unde n este numărul de copii înainte de divizare. Astfel, o plasmidă prezentă în 10 exemplare riscă să se piardă la fiecare 1024 de divizii. Cu 20 de exemplare, această probabilitate scade la mai puțin de o șansă la un milion (probabilitate redusă în continuare de volumul de plasmide din celulă). Oricât de rară ar fi, această pierdere rămâne totuși un avantaj evolutiv față de celulele care trebuie să suporte încă sarcina a douăzeci de plasmide.

Stabilizarea unei plasmide cu număr mic de copii în populația care o găzduiește necesită alte mecanisme. Aceste mecanisme sunt de diferite tipuri și sunt adesea combinate pe aceeași plasmidă pentru o mai mare eficiență. Iată o prezentare generală.

Rezoluție multimers

Diferite copii ale unei plasmide au aceeași secvență de ADN . Prin urmare, sunt capabili să facă obiectul unor recombinații omoloage, formând astfel multimeri ai mai multor plasmide. Deoarece reglarea numărului de copii se face în funcție de numărul de origini ale replicării și numărul de plasmide independente, multimerizarea scade numărul unităților totale care trebuie distribuite în celulele fiice și astfel crește probabilitățile de producere. fără o copie plasmidică.

Soluția constă în plasmida pentru a codifica un sistem de recombinază (sau pentru a utiliza un astfel de sistem prezent pe cromozom) permițând rezoluția multimerilor în monomeri. ParCBA Operonul plasmidului RK2 bacteriană este un exemplu de un astfel de sistem care cuprinde genele pentru resolvase PARA, pentru nucleazei parB și pentru o proteină cu o funcție necunoscută, ParC.

Sisteme de partiții active

Sistemele de partiție  sunt compuse din secvențe a căror funcție este similară cu cea a centromerilor eucariote . Unele modele sugerează că aceste secvențe sunt legate de proteine la elemente unice prezente în fiecare celulă fiică. Aceste elemente ar putea fi, de exemplu, localizate pe cromozom sau membrană.

Alte modele propun asocierea plasmidelor prin secvența lor centromerică. Acestea ar fi apoi distribuite în celulele fiice fie prin filamente, fie prin poziționarea perechii pe septul care formează, o plasmidă pe fiecare parte a acestuia.

Exemple de sisteme de partiție active sunt parA al plasmidei R1 (nu trebuie confundat cu parA al operonului parCBA al plasmidei RK2), sop al plasmidei F sau cu plasmida- profagul P1.

Sisteme otravă-antidot

Aceste sisteme sunt, de asemenea, numite module de dependențe ( module de dependență ) sisteme de moarte programată sau sisteme de ucidere post-segregare (PSK sau ucidere „post-segregare” neobișnuită în franceză). Ele au fost identificate pe multe plasmide cu număr mic de copii din bacteriile Gram negative .

În același operon al plasmidei sunt codificate o otravă și un antidot la această otravă ( FIG. 1.A ). Antidotul este relativ instabil în comparație cu otrava, deoarece este degradat rapid de activitatea unei proteaze dependente de ATP . Prin urmare, trebuie menținut într-o concentrație suficientă pentru a contracara efectul otrăvii, care necesită prezența plasmidei. Într-adevăr, dacă, în timpul divizării, o celulă fiică nu primește o copie a plasmidei, antidotul încă prezent în citoplasmă este degradat fără ca acesta să poată fi sintetizat de novo . Prin urmare, otravă poate acționa pentru a ucide celula, de unde și denumirea de ucidere post-segregare ( Figura 1.B ). Termenul „modul de dependență” este, el se referă la faptul că celula este „dependentă” ( dependentă ) de „doza” de antidot pentru a supraviețui.

Antidotul poate fi fie un antisens împiedicând traducerea de otravă mesager ARN ca în hok / sistemul sok , sau o proteină care inhibă acțiunea proteinei otravă prin formarea unui complex cu acesta. Sistemele proteină-proteină, cu unele excepții, au câteva caracteristici comune:

Iată câteva exemple de sisteme de proteine ​​otrăvitoare-antidot listate în tabelul de la sfârșitul articolului:

- ccd

Acest sistem, cel mai bine studiat în prezent, este situat pe plasmida F a Escherichia coli . Cele două gene ale operonului ccd codifică două proteine: antidotul CcdA (72 aminoacizi) și otravul ccdB (101 aminoacizi). Prin izolarea unui ccd mutant rezistent , s-a demonstrat că ținta ccd este ADN giraza , o topoizomerază tip II implicând gestionarea supraîncărcării ADN-ului. Ulterior, s-a demonstrat că ccdB otrăvește giraza și determină ca aceasta să provoace pauze dublu catenare în ADN într-o manieră dependentă de ATP.

Otrăvirea girazei de către ccdB determină inducerea sistemului SOS . Acest sistem este activat în timpul oricărui eveniment care blochează avansul furcii de replicare a ADN-ului . Aceste evenimente pot fi la fel de diverse ca o rupere a ADN-ului, un dimer de timină sau chiar un complex proteic cu ADN. Inducerea SOS blochează procesul de diviziune celulară în timp ce daunele sunt reparate. Pe măsură ce celula continuă să crească, dar nu se împarte, apare filamentoasă.

Auto-reprimarea operonului CCD necesită prezența CcdA ET ccdB . Forma implicată în legarea la ADN este un tetramer (CcdA) 2 - ( ccdB ) 2 , forma liberă ca hexamer (CcdA) 2 - ( ccdB ) 4 , sugerând că scăderea relativă a cantității de CcdA scade represiunea și astfel promovează sinteza acestuia. CcdA41, o ștergere care cuprinde doar 41 aminoacizi C-terminali ai CcdA, își pierde capacitatea de autoreglare, păstrându-și în același timp proprietățile anti-ucidere. Acest lucru sugerează cu tărie că partea N-terminală a CcdA este responsabilă de legarea la promotorul operonului ccd . Această ipoteză este susținută de faptul că o mutație punctuală de la arginină 4 la alanină din CcdA desființează activitatea represivă.

Proteina CcdA este degradată de proteaza Lon, în ciuda afinității sale pentru Lon, care este mult mai mică decât cea pentru ccdB . Modelele oferă fie formele de degradare „accidental” CcdA liber este suficient pentru a provoca uciderea post-segregare , fie că există un proces activ care destabilizează complexul CcdA- ccd .

- pem

Operonul pem al plasmidei R100 ( E. coli ) codifică antidotul PemI (84 aminoacizi) și otravă PemK (110 aminoacizi). Acest sistem este identic cu sistemul parD al plasmidei R1, antidotul fiind apoi numit Kis și otravă Kid, dar vom folosi prenumele pentru a evita orice confuzie cu sistemul parDE detaliat mai jos.

La fel ca și ccd , stabilizarea plasmidei se datorează degradării antidotului PemI de către Lon și auto-reprimarea completă necesită atât otravă, cât și antidot, deși represiunea slabă este observată numai cu antidotul.

Ținta otrăvului PemK ar putea fi DnaB. DnaB este o helicază implicată în inițierea replicării ADN și supraproducția DnaB inhibă acțiunea toxică a PemK). PemK ar acționa ca un inhibitor al diviziunii celulare, chiar dacă s - a observat un efect de ucidere post-segregare la anumite tulpini.

- parDE

RK2 (numit și RP4) este o plasmidă mare de 60 kb (1 kb = o mie de perechi de baze de ADN). Gama sa gazdă este foarte larg in bacterii Gram -negative cu astfel de diferite gazde care E. coli ( enterobacterii ), Agrobacterium tumefaciens (agent patogen bacterian din plante) de rizobii ( simbiotic de impulsuri ) sau Pseudomonas aeruginosa ( patogen uman responsabilă în special pentru infecțiile nosocomiale ). Se găsește acolo în 4 până la 8 copii pe cromozom, în funcție de specie.

Un locus de 3,2 kb numit par este responsabil pentru stabilizarea RK2. Conține cinci gene organizate în doi operoni divergenți. Primul operon, parCBA (2,3 kb), menționat deja mai sus, este responsabil pentru un sistem de rezoluție multimer și al doilea, parDE (0,7 kb), este un sistem de ucidere post-segregational în care ParD este antidotul (83 aminoacizi) și ParE , otravă (103 aminoacizi). Combinația acestor două sisteme permite o rată foarte scăzută de pierdere, dar contribuția relativă a celor doi operoni la stabilizare este variabilă în funcție de tulpina de E. coli și de temperatura de creștere.

Ținta ParE otrava nu a fost încă stabilită, dar ca ccd , ParE determină uciderea celulelor care au pierdut inhibarea replicarea plasmidei, inducerea sistemului SOS precum aparitia bacteriilor filamentoase. Cunoscând pe de o parte diversitatea gazdelor în care sistemul parDE al RK2 este funcțional și, pe de altă parte, dificultatea de a găsi mutanți rezistenți la ParE, se poate crede în mod rezonabil că ParE afectează o funcție esențială și foarte conservată în evoluție, și probabil site-ul foarte activ al țintei sale.

ParE este codificat de o genă care începe o bază în amonte de codonul stop al parD . Dacă in vivo concentrațiile de Pard și ParE sunt necunoscute, cu toate acestea, se poate estima că exprimarea ParE este mult mai mică decât cea a PARD, parE fiind a doua genă a operonului și pornind, de altfel, cu un TTG codon. Nu foarte eficient spre deosebire de alte otrăvuri, care încep cu un codon ATG clasic.

Auto-represiunea este realizată de ParD sau de complexul ParD-ParE, fără nicio detectare a ParE în această represiune. Dacă ParD se găsește sub forma unui dimer în soluție, totuși, 4 molecule de ParD se leagă de promotor .

Structura 3D a ParD este necunoscută, dar predicțiile structurii secundare converg pentru a spune că conține o catena β N-terminală urmată de 3 sau 4 helice α conectate prin bucle scurte. Aceste rezultate sunt în concordanță cu studiile de dicroism circular și spectroscopie de rezonanță magnetică nucleară. ParD s-ar alătura astfel familiei de proteine ​​care leagă ADN-a foii β.

În același mod ca și pentru CcdA și ca pentru PemI, proteaza E. coli responsabilă pentru instabilitatea relativă a ParD este Lon).

- mazEF și alte sisteme cromozomiale

Modulul mazEF (sau chpA ) este situat în operonul rel în aval de gena care codifică proteina RelA. Spre deosebire de cele anterioare, acesta nu este localizat pe o plasmidă, ci în cromozomul E. coli în sine . Prin urmare, nu este un sistem de ucidere post-segregational deoarece, spre deosebire de plasmide, cromozomul nu este „pierdut” ... Secvența sa este parțial omologă cu cea a pem , precum și cu un alt sistem cromozomial al E. coli , chpB . Expresia mazEF (MazE, 82 aminoacizi, fiind antidotul și MazF, 111 aminoacizi, otravă) este inhibată de guanozină-3 ', 5'-bispirofosfat (ppGpp) sintetizat de RelA în timpul deficiențelor extreme în aminoacizi. În acest caz, MazE fiind degradat de proteaza ClpPA, MazF este liber să-și otrăvească ținta (necunoscută), ducând astfel la moartea celulară. Se crede că acest lucru ar permite supraviețuirea populației bacteriene prin sacrificarea multor dintre celulele deficitare.

De asemenea, s-a demonstrat că acest sistem de deces programat ar putea fi indus de antibiotice care inhibă transcripția sau traducerea, cum ar fi rifampicina , cloramfenicolul sau spectinomicina . De asemenea, este activat de sistemul phd / doc despre care vom discuta la scurt timp.

Un alt sistem cromozomial, relBE , a fost descoperit în genomul E. coli K12 și este omolog pentru mai multe sisteme plasmidice sau cromozomiale ale E. coli sau alte specii bacteriene gram-negative, precum și pentru sistemele cromozomiale. chiar archaea . Până în prezent, nu s-a găsit omolog în eucariote, dar s-a demonstrat că RelE de la E. coli este activ și în Saccharomyces cerevisiae și că RelB contracarează acțiunea sa, cel puțin parțial, nivelul de exprimare a RelB fiind relativ scăzut în procedură folosit.

Omologii cromozomiali ai ccd se găsesc și în tulpina patogenă O157: H7 a E. coli , a hok / sok în E. coli sau, alternativ, a parDE în Mycobacterium tuberculosis , Vibrio cholerae sau Yersinia enterocolitica .

- doctorat / doc

În faza sa lizogenică, bacteriofagul P1 al E. coli este prezent ca o plasmidă cu număr mic de copii. Conține modulul PSD phd / doc în care Phd (73 aminoacizi) este antidotul instabil și Doc (126 aminoacizi) otravă stabilă. Doctoratul este degradat de proteaza ClpPX. Doctorul este capabil să auto-regleze operonul, dar este mai eficient în prezența Doc.

Ținta Doc nu este încă cunoscută, dar ar fi implicată într-un pas esențial pentru sinteza proteinelor. S-a stabilit că prezența mazEF a fost necesară pentru funcția de ucidere post-segregativă a doctoratului / doctorului , sugerând că Doc provoacă inhibarea traducerii antidotului MazE, ducând astfel la deces. Prin urmare, aceste două mecanisme ar fi cuplate în cascadă.

- restricție-modificare

Un alt tip de sistem antidot otrăvitor este sistemul de restricție-modificare (RM). De obicei, unul dintre sistemele bacteriene de protecție împotriva ADN-urilor străine (de exemplu, fagul ) este prezența enzimelor de restricție care scindează molecula ADN la sau în apropierea unui anumit sit. Protecția genomului bacteriilor este asigurată prin modificarea enzimelor care metilează molecula ADN, prevenind astfel acțiunea enzimelor de restricție.

Acest sistem funcționează și pentru stabilizarea plasmidelor. Diferența fundamentală cu sistemele „clasice” otrăvitoare-antidot este că cele două enzime nu formează un complex care inactivează enzima de restricție. În plus, efectul de ucidere post-segregare nu s-ar datora unei degradări mai rapide a metilazei, permițând astfel eliberarea otrăvii. A fost propus astfel un model în care diluarea treptată a celor două enzime în timpul diviziunilor succesive ar duce la un punct în care metilarea nu mai este suficient de eficientă, lăsând puținele enzime de restricție rămase pentru a provoca daune ireparabile ADN-ului.

Tabel: Proprietățile sistemelor otravă-antidot

Sistem Locație Antidot , numărul de aminoacizi Otravă , numărul de aminoacizi Ținta otravă Protează degradând antidotul
ccd plasmida F CcdA, 72 CcdB , 101 girază Lon
pem Plasmidele R1 și R100 PemI (sau Kis), 84 PemK (sau Kid), 110 DnaB? * Lon
parDE plasmida RK2 (sau RP4) ParD, 83 ParE, 103 nedeterminat Lon
mazEF (sau chpA ) Cromozomul E. coli MazE (sau ChpAI), 82 MazF (sau ChpAK), 111 nedeterminat ClpAP
doctorat / doc Plasmida P1 Doctor, 73 de ani Doc, 126 nedeterminat ClpXP

*: nu s-a obținut niciun mutant rezistent la PemK, dar supraproducția DnaB inhibă acțiunea PemK, ceea ce sugerează că DnaB este ținta PemK.

Referințe

<img src="https://fr.wikipedia.org/wiki/Special:CentralAutoLogin/start?type=1x1" alt="" title="" width="1" height="1" style="border: none; position: absolute;">