Lipopolizaharidele ( LPS ), denumite și lipoglicani sau endotoxine, sunt molecule mari formate dintr-o lipidă și o polizaharidă formată dintr-un antigen O, un miez exterior și un miez intern legat printr-o legătură covalentă . Se găsesc în membrana exterioară a bacteriilor Gram-negative .
LPS se leagă de receptorul TLR4 și promovează eliberarea de citokine pro-inflamatorii. Este o endotoxină pirogenică . Induce semne clinice la om ( febră , agregare de celule roșii din sânge , șoc septic, scăderea tensiunii arteriale ). Este partea lipidică A care este considerată a fi cea mai toxică (acțiune asupra granulocitelor și celulelor epiteliale ).
În cercetarea de bază, LPS este utilizat pe scară largă pentru a induce inflamații, cum ar fi inducerea ciclooxigenazei-2 pe celule sau organe din cultură, în general, este utilizat la o concentrație de 0,1 mg / ml.
Activitatea toxică a LPS a fost descoperită și numită „endotoxină” de Richard Friedrich Johannes Pfeiffer. El a făcut distincția între exotoxine , pe care le-a clasificat drept toxine eliberate de bacterii în mediu, și endotoxine, pe care le-a considerat păstrate „în interiorul” celulei bacteriene și eliberate numai după distrugerea peretelui celular bacterian. Lucrările ulterioare au arătat că eliberarea LPS din microbii Gram negativi nu necesită neapărat distrugerea peretelui celular bacterian, ci mai degrabă, LPS este secretat ca parte a activității fiziologice normale a traficului de vezicule cu membrană sub membrană. vezicule cu membrană exterioară, care pot conține și alți factori de virulență și proteine.
Astăzi, termenul „endotoxină” este utilizat în principal ca sinonim pentru LPS, deși există unele endotoxine care nu sunt legate de LPS, cum ar fi așa-numitele proteine delta endotoxine secretate de Bacillus thuringiensis .
LPS este componenta principală a membranei exterioare a bacteriilor Gram-negative . Contribuie foarte mult la integritatea structurală a bacteriilor și protejează membrana de anumite tipuri de atac chimic. LPS crește, de asemenea, sarcina negativă a membranei celulare și ajută la stabilizarea structurii generale a membranei. Este de o importanță crucială pentru multe bacterii gram-negative, care mor dacă LPS este mutat sau eliminat. Cu toate acestea, se pare că LPS este neesențială în cel puțin unele bacterii gram-negative, cum ar fi Neisseria meningitidis , Moraxella catarrhalis și Acinetobacter baumannii . LPS induce un răspuns puternic în sistemul imunitar al animalelor normale. El a fost, de asemenea, implicat în aspecte nepatogene ale ecologiei bacteriene, inclusiv aderența la suprafață, susceptibilitatea la bacteriofagi și interacțiunile cu prădători, cum ar fi amibele .
LPS este necesar pentru conformarea corectă a activității Omptin; cu toate acestea, LPS netedă va interfera steric cu omptinele.
Se compune din trei părți:
O-antigen este specific pentru o specie la autre.Il este format din două triosides și dioside. Este o grupare care se repetă de 2 până la 40 de ori. Lanțurile laterale au o structură care conferă specificitate antigenică. În timpul tranziției la starea R ( dură ) a coloniilor, aceste lanțuri laterale sunt pierdute. Permite serogruparea , un pas esențial în identificarea Enterobacteriaceae , în special Salmonella . Unele bacterii precum Haemophilus influenzae nu au un astfel de antigen.
Un polimer glican care se repetă conținut într-un LPS se numește bacteriu O antigen, O polizaharidă sau O lanț lateral. Antigenul O este legat de oligozaharida centrală și cuprinde domeniul cel mai exterior al moleculei LPS. Compoziția lanțului O variază de la tulpină la tulpină. De exemplu, există peste 160 de structuri diferite de antigen O produse de diferite tulpini de E. Coli . Prezența sau absența lanțurilor O determină dacă LPS este considerat dur sau neted. Lanțurile O cu lungime totală ar face LPS neted, în timp ce absența sau reducerea lanțurilor O ar face LPS dur. Bacteriile cu LPS brut au, în general, membrane celulare mai penetrabile de către un antibiotic hidrofob, deoarece LPS brut este mai hidrofob . Antigenul O este expus chiar pe suprafața celulei bacteriene și, prin urmare, constituie o țintă pentru recunoașterea de către anticorpii gazdei.
Domeniul Core conține întotdeauna o componentă oligozaharidică care se leagă direct de lipida A și conține de obicei zaharuri precum heptoză și acid 3-deoxi-D-manno-oct-2-ulosonic (cunoscut și ca KDO, ceto-deoxioctulosonat). Nucleii LPS ai multor bacterii conțin, de asemenea, componente non-glucidice, cum ar fi fosfați, aminoacizi și substituenți etanolaminici.
Lipida A este, în circumstanțe normale, o dizaharidă fosforilată de glucozamină decorată cu mai mulți acizi grași . Aceste lanțuri de acizi grași hidrofobi ancorează LPS în membrana bacteriană, iar restul LPS iese din suprafața celulei. Domeniul lipidic A este responsabil pentru o mare parte din toxicitatea bacteriilor Gram-negative . Când celulele bacteriene sunt lizate de sistemul imunitar , fragmente de membrană care conțin lipida A sunt eliberate în circulație provocând febră, diaree și posibil șoc endotoxic fatal (numit și șoc septic ). Fragmentul lipidic A este o componentă foarte conservată a LPS. Cu toate acestea, structura lipidei A variază între speciile bacteriene și definește o activare imună generală a gazdei.
Lipooligozaharidele (LOS) sunt glicolipide care se găsesc în membrana exterioară a anumitor tipuri de bacterii Gram-negative , cum ar fi Neisseria spp. și Haemophilus spp. Termenul este sinonim cu forma cu greutate moleculară mică a LPS bacterian. LOS joacă un rol central în menținerea integrității și funcționalității membranei exterioare a anvelopei celulei Gram-negative . Lipooligozaharidele joacă un rol important în patogeneza anumitor infecții bacteriene, deoarece pot acționa ca imunostimulatori și imunomodulatori. În plus, moleculele LOS sunt responsabile pentru capacitatea anumitor tulpini bacteriene de a prezenta mimică moleculară și diversitate antigenică, permițând apărării imune a gazdei să scape și contribuind astfel la virulența acestor tulpini bacteriene.
Din punct de vedere chimic, lipo-oligozaharidele sunt lipsite de antigene O și au doar o porțiune de ancorare a membranei externe pe bază de lipide A și un miez oligozaharidic. În cazul Neisseria meningitidis , lipida A a moleculei are o structură simetrică, iar miezul interior este compus din reziduuri de acid 3-deoxi-D-manno-2-octulosonic (KDO) și heptoză (Hep). Lanțul oligozaharidic al nucleului exterior variază în funcție de tulpina bacteriană. Termenul lipo-oligozaharidă este utilizat pentru a desemna forma cu greutate moleculară mică a lipopolizaharidelor bacteriene, care poate fi clasificată în două forme: forma cu greutate moleculară ridicată (Mr sau netedă) are un lanț O de polizaharide cu greutate moleculară repetată, în timp ce forma greutății (Mr scăzut sau dur), nu are lanțul O, dar are în schimb o oligozaharidă scurtă.
Fabricarea LPS poate fi modificată pentru a prezenta o structură specifică de zahăr. Acestea pot fi recunoscute fie de alte LPS (care ajută la inhibarea toxinelor LPS), fie de glicozil-transferazele care folosesc această structură de zahăr pentru a adăuga zaharuri mai specifice. S-a demonstrat că o enzimă specifică din intestin ( fosfataza alcalină ) poate detoxifica LPS prin îndepărtarea celor două grupări fosfat prezente în carbohidrații LPS. Acest lucru poate servi drept mecanism de coping pentru a ajuta gazda să facă față efectelor potențial toxice ale bacteriilor Gram negative care se găsesc în mod normal în intestinul subțire. O altă enzimă poate detoxifica LPS atunci când intră sau este produsă în țesuturile animale. Neutrofilele, macrofagele și celulele dendritice produc o lipază, aciloxiacilhidrolaza (AOAH), care inactivează LPS prin îndepărtarea celor două lanțuri acil secundare ale lipidei A. Dacă li se administrează LPS oral, șoarecii fără AOAH dezvoltă titri mari de anticorpi nespecifici, dezvoltă hepatomegalie prelungită și au toleranță prelungită la endotoxine. Poate fi necesară inactivarea LPS pentru animale pentru a recâștiga homeostazia după expunerea parenterală la LPS.
LPS acționează ca o endotoxină prototipică, deoarece se leagă de complexul receptor CD14 / TLR4 / MD2 în multe tipuri de celule, dar în special în monocite , celule dendritice , macrofage și celule B , care promovează secreția de citokine medicamente pro- inflamatorii , oxid nitric și icosanoizi .
Ca parte a răspunsului la stres celular, superoxidul este una dintre principalele specii reactive de oxigen induse de LPS în diferite tipuri de celule care exprimă TLR ( receptor de tip Toll ).
LPS este, de asemenea, un pirogen exogen (substanță care induce febra).
Fiind de o importanță crucială pentru bacteriile gram-negative, aceste molecule constituie ținte potențiale pentru noi agenți antimicrobieni .
Unii cercetători au îndoieli cu privire la efectele toxice pe scară largă atribuite tuturor lipopolizaharidelor, în special cianobacteriilor .
Funcția LPS a făcut obiectul unor cercetări experimentale de câțiva ani datorită rolului său în activarea multor factori de transcripție . LPS produce, de asemenea, multe tipuri de mediatori implicați în șocul septic . Oamenii sunt mult mai sensibili la LPS decât alte animale (de exemplu, șoareci). O doză de 1 µg / kg induce șoc la om, dar șoarecii vor tolera o doză de o mie de ori mai mare. Acest lucru poate fi legat de diferențele dintre nivelurile de anticorpi naturali care circulă între cele două specii. Said și colab. a arătat că LPS provoacă o inhibare a expansiunii și funcției celulelor T CD4 + dependente de IL-10 reglând pozitiv rata PD-1 pe monocite , ceea ce duce la generarea de IL 10 de către monocite după legarea PD-1 de către PD-L1 .
Endotoxinele sunt în mare parte responsabile de manifestările clinice dramatice ale infecțiilor cu bacterii gram-negative patogene, cum ar fi Neisseria meningitidis , agenții patogeni responsabili de boala meningococică , inclusiv meningococcemia , sindromul Waterhouse-Friderichsen și meningita .
Bruce Beutler a primit o parte din Premiul Nobel pentru fiziologie sau medicină din 2011 pentru munca sa care a arătat că TLR4 este receptorul LPS.
Porțiuni de LPS din mai multe tulpini bacteriene s-au dovedit a fi chimic similare cu moleculele de pe suprafața celulelor gazdă umane. Capacitatea unor bacterii de a se prezenta pe suprafața lor molecule care sunt identice din punct de vedere chimic sau similare cu moleculele de suprafață ale anumitor tipuri de celule gazdă se numește mimică moleculară. De exemplu, în Neisseria meningitidis L2,3,5,7,9, partea tetrazaharidă terminală a oligozaharidei (lacto-N-neotetraoză) este aceeași tetrazaharidă găsită în paraglobozida, un precursor al antigenelor glicolipide ABH găsite pe eritrocitele umane . Într-un alt exemplu, trizaharida terminală (lactotriaoză) parte a oligozaharidei din Neisseria spp. LOS este de asemenea prezent în glicosfingolipide lactoneoseries celulelor umane. Majoritatea meningococilor din grupele B și C, precum și gonococii , s-au dovedit a avea această trizaharidă în structura lor LOS. Prezența acestor „imitatori” pe suprafața celulelor umane poate, pe lângă faptul că acționează ca un „camuflaj” al sistemului imunitar, să joace un rol în abolirea toleranței imune în timpul infecției gazdelor de către anumite genotipuri ale virusului. ' antigen leucocitar uman (HLA), cum ar fi HLA-B35.
Recent, un nou studiu publicat a constatat că celulele stem hematopoietice (HSC) pot fi detectate direct prin legarea la TLR4, determinându-le să prolifereze ca răspuns la infecția sistemică. Acest răspuns activează semnalizarea TLR4-TRIF-ROS-p38 în cadrul HSC-urilor și, prin activarea prelungită a TLR4, poate induce stres proliferativ, rezultând o capacitate de repopulare competitivă afectată. Infecția la șoareci cu S. typhimurium a dat rezultate similare, validând și modelul experimental in vivo.
Antigenii O (carbohidrații exteriori) constituie cea mai variabilă parte a moleculei LPS, conferind specificitate antigenului. În schimb, lipida A este partea cea mai conservată. Cu toate acestea, compoziția lipidei A poate varia, de asemenea, (de exemplu, numărul și natura lanțurilor de acil chiar și în interiorul sau între genuri). Unele dintre aceste variații pot conferi proprietăți antagonice acestor LPS. De exemplu, Rhodobacter sphaeroides difosforil lipida A (RsDPLA) este un antagonist puternic al LPS în celulele umane, dar este un agonist în celulele de hamster și ecvine. S-a presupus că lipidele conice A (de exemplu de la E. coli ) sunt mai agoniste, lipidele A mai puțin conice decât cele ale Porphyromonas gingivalis care pot activa un semnal diferit ( TLR2 în loc de TLR4) și complet cilindrice ca cele ale Rhodobacter sphaeroides este antagonist față de TLR-uri.
Clusterele genetice LPS variază foarte mult între diferite tulpini, subspecii, specii de agenți patogeni bacterieni din plante și animale.
Ser sânge uman normal conține anticorpi bactericizi anti-LOS și pacienți cu infecții cauzate de tulpini diferite serotypically posedă anticorpi anti-LOS care diferă în specificitate comparativ cu ser normal. Aceste diferențe în răspunsul imun umoral la diferite tipuri de LOS pot fi atribuite structurii moleculei LOS, în principal în structura părții oligozaharidice a moleculei LOS. În Neisseria gonorrhoeae , s-a demonstrat că antigenicitatea moleculelor LOS se poate schimba în timpul infecției datorită capacității acestor bacterii de a sintetiza mai mult de un tip de LOS, o caracteristică cunoscută sub numele de variația fazei. În plus, Neisseria gonorrhoeae și Neisseria meningitidis și Haemophilus influenzae sunt capabile să modifice LOS lor mai in vitro , de exemplu prin sialilarea (modificat cu resturi de acid sialic) și pentru a crește rezistența la distrugerea complementului medierea sau chiar Inhibiția activării a complementului sau eludând efectele anticorpilor bactericide . Sialilarea poate ajuta, de asemenea, la împiedicarea atașării neutrofilelor și a fagocitozei de către celulele sistemului imunitar, precum și la reducerea exploziei oxidative. Haemophilus somnus , un agent patogen la bovine, a arătat, de asemenea, o variație de fază a LOS, o caracteristică care ar putea contribui la evaziunea apărărilor imune ale gazdei bovine . Luate împreună, aceste observații sugerează că variațiile moleculelor de suprafață bacteriene, cum ar fi LOS, pot ajuta agentul patogen să se sustragă atât de apărarea imună umorală (mediată de complement și anticorp), cât și de celulă (neutrofile, de exemplu). Exemplu).
Recent, s-a demonstrat că unii membri ai familiei de canale ionice cu potențial de receptor tranzitoriu, pe lângă căile mediate de TLR4 , recunosc LPS. Activarea TRPA1 de către LPS a fost demonstrată la șoarecii și muștele Drosophila melanogaster . La concentrații mai mari, LPS activează și alți membri ai familiei de canale senzoriale TRP, cum ar fi TRPV1 , TRPM3 și într-o oarecare măsură TRPM8. LPS este recunoscut de TRPV4 pe celulele epiteliale. Activarea TRPV4 de către LPS a fost necesară și suficientă pentru a induce producția de oxid nitric cu efect bactericid.
Prezența endotoxinelor în sânge se numește endotoxemie. Acest lucru poate duce la șoc septic dacă răspunsul imun este foarte puternic.
În plus, endotoxemias de origine intestinală, în special la interfața gazdă-patogen, sunt considerate a fi un factor important în dezvoltarea hepatitei alcoolice , care se poate dezvolta în timpul colonizării bacteriene cronice a intestinului subțire și a intestinului subțire. Rezultat ; crescută intestinal permeabilitate .
Lipida A poate provoca activarea necontrolată a sistemului imunitar la mamifere și producerea de mediatori inflamatori care pot duce la șoc septic . Această reacție inflamatorie este mediată de receptorul Toll-like 4 (TLR4) care este responsabil pentru activarea celulelor sistemului imunitar. Deteriorarea stratului endotelial al vaselor de sânge cauzate de acești mediatori inflamatori poate duce la sindromul de scurgeri capilare, dilatarea vaselor de sânge și scăderea funcției cardiace, precum și șoc septic . Activarea semnificativă a complementului poate fi observată și mai târziu în multiplicarea bacteriilor din sânge. O creștere excesivă a bacteriilor care cauzează leziuni endoteliale distructive poate duce, de asemenea, la diseminarea coagulării intravasculare cu pierderea funcției anumitor organe interne, cum ar fi rinichii, glandele suprarenale și plămânii, din cauza aportului de sânge compromis. Pielea poate prezenta efectele leziunilor vasculare asociate deseori cu scăderea factorilor de coagulare sub formă de petechii , purpură și vânătăi . Membrele pot fi, de asemenea, afectate, uneori cu consecințe devastatoare, cum ar fi dezvoltarea gangrenei , care necesită amputare ulterioară. Pierderea funcției suprarenale poate provoca insuficiență suprarenală și o hemoragie suprarenală suplimentară cauzează sindromul Waterhouse-Friderichsen, ambele putând pune viața în pericol. S-a raportat că LOS gonococic provoacă leziuni ale trompelor uterine umane.
Se crede că mimica moleculară a anumitor molecule LOS provoacă răspunsuri autoimune, cum ar fi apariția sclerozei multiple . Alte exemple de mimetism bacterian al structurilor gazdă prin LOS se găsesc cu bacteriile Helicobacter pylori și Campylobacter jejuni , organisme care cauzează boli gastro-intestinale la om și Haemophilus ducreyi care provoacă șancrul . Unele serotipuri de LPS din C. jejuni (atribuite anumitor fracțiuni tetra și pentazaharide ale oligozaharidei centrale) au fost de asemenea implicate în sindromul de Guillain-Barre și o variantă numită sindrom Miller Fisher .
Studiile epidemiologice au arătat anterior că o creștere a încărcăturii de endotoxine, care poate rezulta dintr-o creștere a numărului de bacterii producătoare de endotoxine în tractul intestinal, este asociată cu anumite grupuri de pacienți legați de obezitate. Studii suplimentare au arătat că endotoxinele purificate din Escherichia coli pot induce obezitatea și rezistența la insulină atunci când sunt injectate în modele de șoareci fără germeni. Un studiu mai recent a constatat că Enterobacter cloacae B29 poate contribui la obezitate și la rezistența la insulină la pacienții umani. Mecanismul presupus pentru asocierea endotoxină-obezitate este că endotoxina induce o cale mediată de inflamație care să țină cont de obezitatea și rezistența la insulină observate. Există o corelație între LPS plasmatic și rezistența la insulină.
Escherichia , Enterobacter sunt genuri bacteriene asociate cu probleme de obezitate legate de endotoxine.
Lipopolizaharide sunt contaminanți comune în ADN plasmida preparată din bacterii sau proteine exprimate de bacterii. Acestea trebuie eliminate din ADN sau proteine pentru a evita contaminarea experimentelor și toxicitatea produselor produse prin fermentarea industrială.
În plus, ovalbumina este frecvent contaminată cu endotoxine. Ovalbumina este una dintre cele mai studiate proteine din modelele animale și un alergen bine stabilit pentru hiperreactivitatea căilor respiratorii. Ovalbumina disponibilă comercial, contaminată cu LPS, poate activa complet celulele endoteliale în timpul analizei in vitro a primei etape a inflamației. Falsifică rezultatele cercetării, deoarece nu reflectă cu exactitate efectul antigenului proteic unic asupra fiziologiei animalelor. În producția farmaceutică, este necesar să se elimine toate urmele de endotoxine din recipientele pentru medicamente, deoarece chiar și cantități mici de endotoxine pot provoca boli la om. În acest scop se utilizează un cuptor de depirogenare. Pentru descompunerea acestei substanțe sunt necesare temperaturi peste 300 ° C. O rată definită de reducere a endotoxinei este o corelație între timp și temperatură. Pe baza materialului de ambalare al seringilor sau fiolelor, este necesară, în general, o temperatură a sticlei de 250 ° C și un timp de 30 de minute pentru a realiza reducerea nivelului de endotoxină cu un factor de 1000.
Testul standard pentru detectarea prezenței endotoxinei este testul de Limatus Amebocyte Lysate (LAL) folosind sângele crabului de potcoavă (Limulus polyphemus) . Nivelurile foarte scăzute de LPS pot provoca coagularea lizatului de potcoavă datorită amplificării puternice printr-o cascadă de enzime. Cu toate acestea, datorită scăderii populației lor și a faptului că există factori care interferează cu testul LAL, s-au făcut eforturi pentru a dezvolta analize alternative, dintre care cele mai promițătoare sunt testele ELISA folosind o versiune recombinantă a unei proteine în Test ALL, factor C.
În testul Ames , se utilizează mutanți lipsiți de LPS deoarece sunt mai permeabili la mutageni .