Secvențierea proteinelor prin spectrometrie de masă

Secvențierea proteinelor prin spectrometrie de masă este o tehnică care permite secvențierea proteinelor prin spectrometrie de masă în special în MS / MS tandem. Face posibilă determinarea secvenței peptidelor pe câteva zeci de aminoacizi . Cuplat cu tehnici de digestie (enzimatică sau chimică) și cu tehnici de separare ( cromatografie lichidă de înaltă performanță, de exemplu), este posibilă caracterizarea unei proteine .

Principiul fragmentării

Fragmentarea este procesul de separare a fiecărui aminoacid într-o peptidă. Din motive de stabilitate a legăturii, secvențele polipeptidice se scindează preferențial la nivelul legăturilor peptidice. Cu toate acestea, există mecanisme complexe care produc alte tipuri de pauze de legătură , ceea ce poate face dificilă citirea spectrelor de masă și determinarea secvenței.

Spectrometrie de masă MS / MS

Pentru a fragmenta peptidele, se utilizează fie mai mulți analizatori cuplați în serie (spectrometru de tip QqQ triplu quadrupol sau tip Q-TOF cvadrupol timp de zbor), fie un analizor capabil să efectueze mai multe analize în serie (spectrometru de masă capcană ionică IT sau FT -Tip de rezonanță ciclotronă ICR).

Primul analizor face posibilă selectarea unui ion care urmează să fie fragmentat (numit „ion părinte”) și excluderea tuturor celorlalți ioni prezenți.
Acest ion părinte este fragmentat, de obicei prin coliziune cu un gaz inert (adică unul care nu reacționează chimic cu ionul părinte) într-o celulă de coliziune. Această fragmentare face posibilă „ruperea” legăturilor moleculare, în special legăturile peptidice, și producerea „ionilor fiice”.
Ionii fiici sunt apoi separați prin al doilea analizor și apoi detectați.

Mod de analiză posibil

Există mai multe moduri de analiză în spectrometria de masă tandem:

Scanare de ioni de fragmente (sau scanare de ioni a produsului sau scanare de fiică )

În acest mod, este selectat un ion părinte cu un raport m / z dat. Este fragmentat, apoi întregul domeniu de masă este scanat pentru a analiza ionii fii produși.

Scanare de ioni precursori (sau scanare părinte )

În acest mod, este analizat un singur ion cu un raport m / z dat. Se scanează întreaga gamă de masă a ionilor părinți. Acest mod face posibilă analiza ionilor părinți care produc în mod specific un ion copil dat.

Scanare de ioni neutri

În acest mod, ionii părinți și ionii fiici sunt analizați pe întreaga gamă de masă. Alegem o masă m1, scanăm ionii părinți pe întreaga gamă de masă și analizăm ionii fii produși cu masa m2-m1. Acest mod face posibilă studierea ionilor părinți care pot pierde un fragment neutru și, prin urmare, nu pot fi analizați prin a doua scanare. De exemplu, putem analiza alcoolii căutând o diferență de masă de 18 Da.

Fără măturare

În acest mod, se determină masa ionului părinte și a ionului copil. Acest mod este utilizat în cuantificare pentru a măsura cantitatea unei molecule date.Tipul fragmentării

Fragmentele pot fi clasificate în funcție de tipurile lor:

Fragmentarea spontană a ionilor metastabili sau fragmentarea indusă de coliziune pe o suprafață ( disocierea indusă de suprafață SID ), cu un gaz inert ( disocierea indusă de coliziune CID ) sau un gaz reactiv ( monitorizarea ionilor reactivi RIM )
Fragmentare cu energie ridicată (de exemplu, cu TOF / TOF), producând o ruptură mare a legăturii sau fragmentare cu energie redusă, minimizând rupturile de legături non-peptidice.

Stabilitatea ionilor

În funcție de energia internă a ionilor, ionii se fragmentează la diferite durate de viață:

ion stabil: mai mult de 10 −6 s
ion metastabil: între 10 −6 și 10 −7 s
ion instabil: mai puțin de 10 −7 s

Serie de fragmentare

Tipuri de fragmentare a, b, c și x, y, z

M = M(n AA) + M(H) + M(OH)

Cod 1 literă	Cod de 3 litere	Amino acid	Liturghii	Aminoacizi modificați
LA	Pentru	Alanyl	71	113 ( acetilare ) 297 ( biotinilare )
VS	Cys	Cistil	103	160 ( Carbamidometilare ) 161 ( Carboximetil ) 174 ( Propionamidare ) 202 ( NIPCAM ) 208 ( S-piridiletilare )
D	Asp	Aspartil	115	129 ( metilesterificare ) 137 ( sodie )
E	Lipici	Glutamil	129	111 ( Pyro-Glu ) 143 ( metilesterificare ) 151 ( Sodiere )
F	Phe	Fenilalanil	147	-
G	Gly	Glicil	57	-
H	A lui	Histidil	137	153 ( oxidare )
Eu	Insulă	Izoleucil	113	-
K	Crini	Lizil	128	255 ( SMA )
L	Leu	Leucyl	113	-
M	Întâlnit	Metionil	131	147 ( oxidare ) 163 ( sulfonare )
NU	Asn	Asparagil	114	-
P	Pro	Prolyl	97	-
Î	Gln	Glutamil	128	111 ( Pyro-glu în termenul N)
R	Arg	Arginil	156	-
S	Ser	Seryl	87	167 ( fosforilare )
T	Thr	Treonil	101	181 ( fosforilare )
V	Val	Valyl	99	-
W	Trp	Triptofanil	186	206 ( oxidare )
Da	Tyr	Tirozil	163	243 ( fosforilare )

Cu N modificări ale terminalului

Modificare	Masa
Acetilare	+ 42 Da
Biotinilarea	+ 226 Da
Carbamilare	+ 43 Da
Formilare	+ 28 Da
SMA	+ 127 Da

Cu modificări ale terminalului C.

Modificare	Masa
Esterificarea metilică	+ 14 Da
Sodierea	+ 22 Da

Fragmentarea la legătura peptidică

Fragmentarea unui singur link N fragmentare terminală Ion seria a

Fragmentarea seriei a produs ioni aldimină:

M = M(n AA) + M(H) - M(CO) = M(n AA) - 27

Seria a * derivă din seria a prin pierderea unui grup NH 3 :

M = a - M(NH3) = a - 17

Seria a 0 derivă din seria a prin pierderea unui grup H 2 O:

M = a - M(H2O) = a - 18 Seria B ionică

Fragmentarea seriei b produce ioni de aciliu:

M = M(n AA) + M(H) = M(n AA) + 1

B * derivă din seria din seria B , prin pierderea unei NH 3 grup :

M = b - M(NH3) = b - 17

Seria b 0 derivă din seria b prin pierderea unui grup H 2 O:

M = b - M(H2O) = b - 18 Capătul terminalului N

Fragmentul peptidic cu greutate moleculară mai mică din seria b corespunde capătului N al peptidei părinte. Acesta corespunde formulei:

R NH2-CH-CO

și dă un vârf cu un raport m / z:

m/z = M(H) + M(aa) = M(aa) + 1 Terminați terminalul C

Fragmentul peptidic cu greutate moleculară mai mare din seria b corespunde capătului C al peptidei părinte [M + H] +. Acesta corespunde formulei:

R NH2-...-(CH)-...-CO

Diferența de masă dintre acest fragment și peptida mamă corespunde, prin urmare, ultimului aminoacid aa n :

m/z = M(ion parent M[M+H]+) - M(fragment peptidique) = ( M(H) + ΣM(aa) + M(aan + M(OH) + M(H+) ) - ( M(H) + ΣM(aa) ) = M(aan ) + 18

În special, în cazul unei digestii triptice , aminoacidul C terminal corespunde unei lizine sau unei arginine . În funcție de acest aminoacid, se observă un vârf care apare cu următoarele diferențe comparativ cu raportul m / z al ionului părinte [M + H] +:

m/z = 146 pour la lysine

și

m/z = 174 pour l'arginine Seria C ionică

Fragmentarea seriei c produce amino ioni:

M = M(n AA) + M(H) + M(NH3) = M(n AA) + 18 Fragmentarea terminalului C Ion seria x

Fragmentarea seriei x produce ioni de aciliu:

M = M(n AA) + M(CO) + M(OH) = M(n AA) + 45 Seria ionilor Y

Fragmentarea seriei produce amino ioni în ea:

M = M(n AA) + M(2H) + M(OH) = M(n AA) + 19

Y * Seria este derivată din seria y prin pierderea unei NH 3 grup :

M = y - M(NH3) = y - 17

Seria y 0 derivă din seria y prin pierderea unui grup H 2 O:

M = y - M(H2O) = y - 18 Terminați terminalul C

Fragmentul peptidic cu greutate moleculară mai mică din seria y corespunde capătului C al peptidei părinte. Acesta corespunde formulei:

R NH3+-CH-COO

și dă un vârf cu un raport m / z:

m/z = 2M(H) + M(aa) + M(OH) = M(aa) + 19

În special, în cazul unei digestii triptice , aminoacidul C terminal corespunde unei lizine sau unei arginine . În funcție de acest aminoacid, se observă un vârf la valorile:

m/z = 147 pour la lysine

și

m/z = 175 pour l'arginine Capătul terminalului N

Cel mai mare fragment peptidic cu greutate moleculară din seria y corespunde capătului N-terminal al peptidei părinte. Acesta corespunde formulei:

R NH3+-...-(CH)-...-COO

Diferența de masă dintre acest fragment și ionul părinte [M + H] + corespunde, prin urmare, primului aminoacid aa 1 :

m/z = M(ion parent M[M+H]+) - M(fragment peptidique) = ( M(H) + ΣM(aa) + M(aa1 + M(OH) + M(H+) ) - ( 2M(H) + ΣM(aa) + M(OH) ) = M(aa1 ) Seria Z ionică

Fragmentarea seriei Z produce carbocații:

M = M(n AA) - M(NH) + M(OH) = M(n AA) + 2 Fragmentarea a două verigi Ion de fragmentare internă

Acești ioni corespund scindării a două legături peptidice. Aceste clivaje corespund în general fragmentărilor de tip b și y și formează ioni de amino-aciliu:

M = M(n AA) + M(2H) = M(n AA) + 2

Uneori, clivajele corespund fragmentărilor de tip a și y și produc ioni amino-iminium:

M = M(n AA) + M(H) - M(CO) = M(n AA) - 27 Ion iminium

Când o fragmentare de tip o este aproape de o fragmentare de tip y, se formează un ion iminium :

M = M(AA) + M(H) - M(CO) = M(AA) - 27

Ionii de imoniu apar într-un spectru MS / MS la mase mai mici de 200 Da. Acestea fac posibilă cunoașterea compoziției de aminoacizi a peptidei fragmentate.

Amino acid	Cod de 3 litere	Cod 1 literă	Masa	Derivat de ion de imoniu
Acid aspartic	Asp	D	88	70
Acid glutamic	Lipici	E	102	-
Alanină	Pentru	LA	44	-
Arginina	Arg	R	129	59, 70, 73, 87, 100, 112
Asparagine	Asn	NU	87	70
Cisteina	Cys	VS	76	-
Glutamina	Gln	Î	101	56, 84, 129
Wisteria	Gly	G	30	-
Histidină	A lui	H	110	82 , 121 , 123 , 138 , 166
Isoleucina	Iso	Eu	86	44, 72
Leucina	Leu	L	86	44, 72
Lizină	Crini	K	101	70 , 84, 112, 129
Metionină	Întâlnit	M	104	61
Fenilalanină	Phe	F	120	91
Proline	Pro	P	70	-
Serine	Ser	S	60	-
Treonina	Thr	T	74	-
Triptofan	Trp	W	159	77, 117, 130 , 132, 170 , 171
Tirozină	Tyr	Da	136	91 , 107
Valine	Val	V	72	41, 55, 69

Fragmentarea lanțurilor laterale

Ion seria d

Un ion din seria d se formează prin pierderea unei părți a lanțului lateral al aminoacidului C terminal al unui ion din seria a.

M = M(AA) + M(H) - M(CO) - M(Rperdu) = M(AA) - 27 - M(Rperdu) Ion seria v

Un ion din seria V se formează prin pierderea lanțului lateral de aminoacizi N terminal al unui ion din seria y.

M = M(AA) + M(OH) - M(Rperdu) = M(AA) + 17 - M(Rperdu) Ion seria w

Un ion din seria w se formează prin pierderea unei părți a lanțului lateral al aminoacidului N terminal al unui ion din seria z.

M = M(AA) + M(OH) - M(NH) - M(Rperdu) = M(AA) + 2 - M(Rperdu)

Secvențierea proteinelor prin spectrometrie de masă

Principiul fragmentării

Serie de fragmentare

Fragmentarea la legătura peptidică

Fragmentarea lanțurilor laterale

Lista modificărilor proteinelor