Secventiere ADN - ul este de a determina ordinea secvenței de nucleotide la un fragment de ADN dat.
Secvența de ADN conține informația că lucrurile vii au nevoie pentru a supraviețui și a se reproduce. Prin urmare, determinarea acestei secvențe este utilă atât pentru cercetări care vizează cunoașterea modului în care trăiesc organismele, cât și pentru subiecții aplicați. În medicină , poate fi folosit pentru a identifica, diagnostica și găsi potențial tratamente pentru boli genetice și virologie . În biologie , studiul secvențelor ADN a devenit un instrument important pentru clasificarea speciilor .
Secvențierea ADN a fost inventată în a doua jumătate a anilor 1970. Două metode au fost dezvoltate independent, una de către echipa lui Walter Gilbert din Statele Unite , iar cealaltă de cea a lui Frederick Sanger (în 1977), în Regatul Unit . Aceste două metode se bazează pe principii diametral opuse: abordarea Sanger este o metodă prin sinteză enzimatică selectivă, în timp ce cea a lui Maxam și Gilbert este o metodă prin degradare chimică selectivă. Pentru această descoperire, Gilbert și Sanger au primit Premiul Nobel pentru chimie în 1980.
Inițial, metoda lui Sanger cerea disponibilitatea ADN monocatenar care a servit drept șablon pentru sinteza enzimatică a catenei complementare. Din acest motiv, primul organism biologic al cărui genom a fost secvențiat în 1977 este virusul bacteriofagului φX174 . Acest virus are proprietatea de a avea un genom alcătuit din ADN monocatenar care este încapsulat în particula virală.
În ultimii 25 de ani, metoda Sanger a fost dezvoltată pe scară largă datorită mai multor progrese tehnologice importante:
Metoda lui Maxam și Gilbert necesită reactivi chimici toxici și rămâne limitată în ceea ce privește dimensiunea fragmentelor de ADN pe care le poate analiza (<250 nucleotide). Mai puțin ușor de robotizat, utilizarea sa a devenit acum confidențială.
Această metodă este utilizată în mod convențional pentru a efectua secvențierea punctelor mici. Pentru secvențierea unui întreg genom, se folosește în schimb secvențierea generației următoare. Principiul acestei metode constă în inițierea polimerizării ADN-ului folosind o mică oligonucleotidă (primer) complementară unei părți a fragmentului de ADN care urmează a fi secvențiat. Extinderea primerului este realizată de fragmentul Klenow (o ADN polimerază I lipsită de activitate de exonuclează 5 '→ 3') și menținută de ADN polimeraze termostabile , cele care sunt utilizate pentru PCR . Se adaugă cele patru dezoxiribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), precum și o concentrație scăzută a uneia dintre cele patru dideoxiribonucleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP sau ddTTP).
Aceste dideoxiribonucleotide acționează ca „otrăvuri” terminatoare de lanț: odată încorporate în noua catenă sintetizată, previn alungirea suplimentară deoarece nu au capăt 3'-OH (doar un hidrogen în loc de hidroxil). Această terminare are loc în mod specific la nivelul nucleotidelor corespunzătoare dideoxiribonucleotidei încorporate în reacție. Pentru secvențierea completă a aceluiași fragment de ADN, această reacție se repetă de patru ori în paralel, cu cele patru dideoxiribonucleotide diferite.
De exemplu, în reacția în care s-a adăugat ddGTP, sinteza se oprește la nivelul lui G. Amestecul de reacție conținând atât dGTP cât și puțin ddGTP, încetarea are loc statistic în funcție de dacă ADN polimeraza utilizează oricare dintre aceste nucleotide. Acest lucru are ca rezultat un amestec de fragmente de ADN de dimensiuni crescânde, toate care se termină la unul dintre G-urile din secvență. Aceste fragmente sunt apoi separate prin electroforeză pe un gel de poliacrilamidă , ceea ce face astfel posibilă identificarea poziției Gs în secvență.
Detectarea fragmentelor astfel sintetizate se face prin încorporarea unui trasor în ADN-ul sintetizat. Inițial acest trasor era radioactiv; astăzi, se folosesc trasoare fluorescente, atașate fie la oligonucleotidă, fie la dideoxiribonucleotidă.
Această metodă se bazează pe o degradare chimică a ADN-ului și utilizează diferitele reactivități ale celor patru baze A, T, G și C, pentru a realiza clivaje selective. Prin reconstituirea ordinii tăieturilor, putem reveni la secvența nucleotidică a ADN-ului corespunzător. Această secvențiere chimică poate fi împărțită în șase etape succesive:
Cunoașterea structurii unui genom în întregime poate trece prin secvențierea acestuia. Cu toate acestea, dimensiunea genomului fiind de câteva milioane de baze (sau megbaze), este necesar să se cupleze abordările de biologie moleculară cu cele ale științei computerizate pentru a putea procesa un număr atât de mare de date.
Sunt utilizate două principii principale ale secvențierii întregului genom. În ambele cazuri, ADN-ul genomic este mai întâi fragmentat prin metode enzimatice ( enzime de restricție ) sau fizice ( cu ultrasunete ):
Principala diferență dintre aceste două principii este că secvențierea ierarhică încearcă să alinieze un set de clone mari (~ 100 kb), în timp ce în metoda generală întregul genom este redus în fragmente mici care sunt secvențiate și apoi aliniate.
După extracție, ADN-ul genomic este tăiat prin sonicare în fragmente de 50 până la 200 kb și apoi clonat într-un vector adecvat, cum ar fi cromozomii artificiali bacterieni sau BAC. Numărul de clone ar trebui să permită o acoperire de 5 până la 10 ori lungimea totală a genomului studiat. Suprapunerea și ordonarea clonelor se realizează fie prin hibridizarea sondelor specifice, fie prin analiza profilelor de restricție , sau mai frecvent printr-o ordonare după secvențierea și hibridizarea capetelor BAC-urilor. După ordonarea clonelor, acestea sunt fragmentate și secvențiate individual, apoi asamblate prin alinierea bioinformatică.
Avantajele acestei metode sunt o ușurință mai mare de asamblare a fragmentelor datorită suprapunerii BAC-urilor, posibilitatea comparării fragmentelor cu bazele de date disponibile și posibilitatea partajării lucrărilor de secvențiere între mai multe laboratoare, fiecare având un responsabil regiunea cromozomială.
Dezavantajul major este dificultatea clonării fragmentelor care conțin secvențe repetate, care sunt foarte frecvente la anumite genomi, cum ar fi cele ale mamiferelor, ceea ce face dificilă analiza bioinformatică finală.
Este o metodă de secvențiere a ADN-ului genomic concepută inițial în laboratorul lui Frederick Sanger din Cambridge la sfârșitul anilor 1970 pentru a secvența primii genomi ai virușilor.
Această metodă a fost popularizată de Craig Venter pentru secvențierea genomilor mari, în special în cadrul companiei Celera Genomics . Prima aplicație a fost secvențierea genomului bacterian, apoi a genomului Drosophila și în cele din urmă a genomului uman și murin . Pentru a efectua secvențierea completă a genomului folosind această tehnică, sunt realizate două până la trei biblioteci compuse din fragmente aleatorii de ADN genomic . Între biblioteci, fragmentele diverg atât în mărime, cât și în localizare pe genom . Din aceste biblioteci, multe clone sunt secvențiate și apoi asamblate. Secvența totală este obținută prin procesarea tuturor bibliotecilor folosind instrumente de bioinformatică, prin alinierea fragmentelor folosind secvențele suprapuse.
Avantajele față de secvențierea prin secvențierea ierarhică sunt viteza tehnicii și costuri mai mici. Dezavantajul este că prelucrarea computerizată nu face posibilă alinierea fragmentelor care cuprind secvențe repetate mari, care sunt frecvent prezente în genomul mamiferelor.
Această metodă este denumită în mod obișnuit pușca ( pușca tăiată) sau Pușca de genom întreg (WGS). Această metaforă ilustrează natura aleatorie a fragmentării inițiale a ADN genomic: întregul genom este pulverizat, cam ca peletele acestui tip de armă de foc sunt dispersate.
Secvențierea prin hibridizare se bazează pe utilizarea cipurilor ADN care conțin de la câteva sute (pentru cipurile de prima generație) la câteva mii de oligonucleotide. ADN-ul care urmează să fie analizat este tăiat în mai multe fragmente care sunt apoi incubate pe cipul în care se vor hibridiza cu oligonucleotidele la care sunt complementare. Citirea cipului (detectarea oligonucleotidelor hibridizate) face posibilă obținerea spectrului secvenței ADN , adică compoziția sa în subsecvențe de n nucleotide, unde n este dimensiunea sondelor de pe cipul utilizat. Procesarea computerizată a spectrului face posibilă reconstituirea întregii secvențe.
o adaptare a tehnicii lui Sanger care folosește fluorescența în loc de radioactivitate . Dideoxinucleotidele încorporate sunt marcate în mod specific cu molecule fluorescente sau fluorofori „ fluorocromici ” (ddATP-JOE, ddCTP-5-FAM, ddGTP-TAMRA și ddTTP-ROX).
Reacția de secvență este efectuată prin PCR . Polimerază Taq efectuează alungire la încorporarea unui dideoxinucleotidei marcat cu fluorescență. Fragmentele sintetizate sunt apoi separate prin electroforeză .
Un dispozitiv automat ia reacția de secvență și o injectează într-un capilar care conține un polimer de poliacrilamidă . În timpul migrației, un sistem laser optic detectează fluorescența care trece în fața ferestrei laser și care este emisă de ddNTP care termină fragmentul sub excitație (lumină verde pentru JOE „ddATP”, albastră pentru 5-FAM „ddCTP”, galben pentru TAMRA „ddGTP” și roșu pentru ROX „ddTTP”.
Prin separarea acestor molecule prin electroforeză în funcție de mărimea lor, se pot citi literele succesive care apar sub formă de curbe pe o electropherogramă (sau fluorogramă ) a cărei fluorescență corespunde bazei acestui ddNTP de încheiere. Software-ul de analiză face posibilă realizarea corespondenței dintre curbele de fluorescență și nucleotida încorporată.
Informațiile sunt înregistrate electronic, iar secvența interpretată este stocată în baza de date a computerului. Se spune că acest tip de secvențiere are un randament ridicat, deoarece multe secvențe pot fi realizate în același timp. Într-adevăr, în funcție de modelele secvențiale, 1, 6, 12 sau chiar 36 de capilare pot funcționa în paralel, știind că automatul poate injecta succesiv 96 de reacții de secvență, conținute într-o placă, în fiecare dintre capilare. Durata redării este de aproximativ 1 kb per secvență. Timpul pentru o rulare a unei secvențe este de aproximativ 10 minute. Într-o noapte, cu 12 capilare, secvențierul poate obține automat citirea de 1 Mb.
Compararea metodelor de secvențiere de generația următoareMetodă | Lungimea lecturii | precizie | Citind după experiență | timp de experiență | cost pe 1 milion de baze (în dolari SUA $) | Beneficii | Dezavantaje |
---|---|---|---|---|---|---|---|
Secvențierea unei singure molecule în timp real (Pacific Biosciences) | 10.000 bp până la 15.000 bp în medie (14.000 bp N50); lungime maximă de citire> 40.000 baze | 87% | 50.000 pe celulă sau 500–1000 de baze de date | 30 minute până la 4 ore | 0,13 USD - 0,60 USD | lecturi lungi. Rapid. Detectează 4mC, 5mC, 6mA | debit moderat, echipamentul poate fi foarte scump |
Semiconductor ionic ( secvențierea Ion Torrent ) | până la 400 bp | 98% | până la 80 de milioane | 2 ore | 1 $ | cel mai ieftin și mai rapid echipament | erori homopolimerice |
Pirozecventare ( 454 ) | 700 bp | 99,9% | 1 milion | 24 de ore | 10 USD | citiri lungi, rapide | experimentul este costisitor, erori homopolimerice |
Secvențierea prin sinteză (Illumina) | 50 până la 300 bp | 99,9% | până la 6 miliarde | 1 până la 11 zile | 0,05 USD până la 0,15 USD | Potențial mare de transfer al secvenței, în funcție de modelul secvențial și de aplicația dorită | Echipamentul poate fi foarte scump. Necesită concentrații mari de ADN. |
Secvențierea ligii (secvențierea SOLiD) | 50 + 35 sau 50 + 50 bp | 99,9% | n / A | 20 minute până la 3 ore | 2400 USD | lecturi lungi. Util pentru multe aplicații. | Mai scump și incomod pentru proiectele mari de secvențiere. Această metodă necesită, de asemenea, timp pentru clonarea plasmidei sau etapa PCR. |
Numele de familie | Număr de mașini (la nivel mondial) |
---|---|
Illumina HiSeq 2000 | 5490 |
Analizorul genomului Illumina 2x | 411 |
Stânca 454 | 382 |
ABI SOLiD | 326 |
Ion Torrent | 301 |
Illumina MiSeq | 299 |
Ion Proton | 104 |
Pacific Biosciences | 50 |
Oxford Nanopore MinION | 14 |
Illumina NextSeq | 3 |
Secvențierea nanoporei este o metodă în curs de dezvoltare din 1995 pentru secvențierea ADN-ului.
Un nanopor este pur și simplu o gaură mică cu un diametru intern de ordinul a 1 nanometru. Unele proteine celulare transmembranare poroase acționează ca niște fire, nanoporii au fost de asemenea realizați prin gravarea unei găuri puțin mai mari (câteva zeci de nanometri) într-o bucată de siliciu.
Teoria din spatele secvențierii nanoporilor este după cum urmează: Când un nanopor este scufundat într-un fluid conductor și se aplică un potențial (tensiune) peste el, se poate observa un curent electric datorat conducerii ionilor prin nanopor. Cantitatea de curent este foarte sensibilă la dimensiunea și forma nanoporului. Dacă nucleotide (baze) unice, fire de ADN sau alte molecule trec prin sau în apropierea nanoporului, acest lucru poate crea o schimbare caracteristică a magnitudinii curentului prin nanopor.
Devreme în a doua jumătate a XX - lea secol, raportul dintre medicina umană era încă dominată de dorința de a înțelege și trata boala și diverse amenințări organizației. Cu toate acestea, înțelegerea modului în care funcționează s-a adâncit mult în ultimele decenii, în special datorită îmbunătățirii și apariției diferitelor tehnici. Însuși conceptul de sănătate, adică mai degrabă o absență a patologiei, a fost redefinit în mod natural pentru a însemna mai degrabă un sentiment de bunăstare generală a unui individ, atât fizic cât și moral. Astfel, noile strategii comerciale au devenit democratizate pentru a oferi fiecărui individ posibilitatea de a avea grijă de propria sa integritate fizică. (medicamente fără prescripție medicală, alimente sănătoase etc.).
Secvențierea ADN-ului este o tehnică care se află în centrul acestei redefiniri a concepției despre sănătate și a relației cu „viețuitoarele” în general, deoarece sugerează un tratament optim și personalizat pentru fiecare persoană. Piața datelor genetice s-a dezvoltat foarte rapid și numeroase investiții de la crearea sa au dus la o scădere foarte puternică a prețurilor.
Prima secvențierea completă a genomului uman a fost finalizat în 2003 și a durat aproximativ zece ani de muncă, cu o investiție totală de 2,7 miliarde $. La acea vreme, metoda Sanger era încă intens utilizată pentru a descifra cele aproximativ 3 miliarde de perechi de nucleotide care alcătuiesc ADN-ul nostru. Au apărut apoi multe proiecte (în special 1000 de genomi , ENCODE ...) și au fost dezvoltate noi mașini (menționate mai sus) cu scopul de a genera secvența completă a unui genom uman pentru mai puțin de 1000 de dolari. Odată cu îmbunătățirea metodelor de secvențiere, prețul secvențierii parțiale a unui genom uman de înaltă calitate a fost estimat la 14 milioane de dolari în 2006, relativ mai puțin costisitor în comparație cu proiectul finalizat în 2003. La sfârșitul anului 2015, prețul pentru a genera un o singură serie a fost de aproximativ 1.500 de dolari.
Odată cu apariția acestor noi metode mult mai eficiente, grupate sub acronimul NGS , mai rapide și mai puțin costisitoare, piața secvențierii ADN a explodat și multe aplicații din diferite domenii sunt disponibile astăzi. Unele companii precum Illumina oferă acum un serviciu de secvențiere a ADN-ului, accesibil financiar persoanelor fizice.
Secvențierea ADN- ului poate fi utilizată pentru a determina secvența genelor individuale, a regiunilor genetice mari, a cromozomilor complet sau a genomului întreg, a oricărui organism. Secvențierea ADN-ului a devenit o tehnologie cheie în multe domenii ale biologiei și al altor științe precum medicina, criminalistica sau antropologia .
În biologia moleculară, secvențierea genomului permite studiul proteinelor codificate, cercetătorii identifică modificările genelor și le asociază cu anumite boli pentru a viza potențialele medicamente.
Secvențierea a făcut posibilă înțelegerea originii genetice a anumitor tipuri de cancer care apar din cauza acumulării de mutații în genele critice care modifică programele normale de proliferare, diferențiere și deces celular. Kinaza RAS-RAF-MEK-ERK-MAP implică răspunsuri celulare la semnale de creștere și în aproximativ 15% din cancerul uman gena RAS este mutată provocând o formă oncogenă.
Întrucât ADN-ul este o macromoleculă informativă în ceea ce privește transmiterea generație-generație, secvențierea ADN-ului este utilizată în biologia evoluției pentru a studia relația diferitelor organisme și modul în care acestea au evoluat, pe baza studiilor de colaborare între paleogenetieni și antropologi. Analiza ADN-ului țesuturilor umane, în principal osoase și dentare, îngropate în necropole, face posibilă definirea haplogrupurilor și estimarea originii lor biogeografice, precum și rutele de migrație pe care le-ar fi putut lua cu sute sau mii de ani în urmă, pentru a compara caracteristicile lor genetice cu cele ale populațiilor actuale sau pentru a stabili unele dintre trăsăturile lor fizice. Datorită scăderii prețului secvențierii genomului, companiile oferă publicului, ca serviciu plătit, să urmărească originile unei persoane dintr-un kit simplu de utilizat acasă.
Geneticienii medicali pot secvența genele la pacienți pentru a determina dacă există riscul bolilor genetice. Este o examinare a caracteristicilor genetice ale persoanei. Diagnosticul este de obicei pre sau post-natal. De exemplu, diagnosticul prenatal poate detecta o boală ereditară responsabilă de o dizabilitate gravă sau tulburări de comportament și psihologice și poate alege părinții al căror copil este diagnosticat dacă continuă sau nu sarcina. Informațiile despre variațiile genetice ( polimorfisme cu nucleotide unice ) ghidează, de asemenea, managementul terapeutic și permite consiliere genetică pentru membrii familiei.
Din ce în ce mai mult, examinarea caracteristicilor genetice se face prin secvențierea ADN cu randament ridicat (NGS). În general, în prezent, sunt secvențiate mai degrabă doar părțile codificatoare ale genelor, în care sunt descrise 2/3 din mutații. Prin urmare, NGS face posibilă secvențierea simultană a tuturor părților codificatoare ale genelor unei persoane, care se numește exom .
În diagnosticul prenatal, DPNI este stabilit ca o tehnică de detectare sigură și precoce a sindromului Down sau a altor anomalii cromozomiale sau chiar a anumitor mutații punctuale. Nu este un diagnostic, ci doar un screening. Consistă în preluarea sângelui de la mamă în timpul sarcinii. Acest sânge conține în mod natural o cantitate mică de fragmente de ADN de la făt, iar geneticienii nu îl pot separa de fragmentele de ADN aparținând mamei, care pot fi găsite și în sânge. DPNI este, prin urmare, o secvențiere de mare viteză a tuturor fragmentelor de ADN care circulă în sângele matern, apoi o analiză computerizată a rezultatelor. DPNI înseamnă Screening prenatal prin tehnică non-invazivă. În funcție de rezultate, este indicată confirmarea anomalii, care implică amniocenteză .
Medicina reproducerii este ramura medicinei care studiază fiziologia reproducerii, precum și patologia acesteia, infertilitatea. Această abordare a medicinei vizează îmbunătățirea sănătății reproducerii.
Secvențierea ADN, în special a celulelor sexuale, a făcut posibilă înțelegerea modificărilor genetice care cauzează un dezechilibru în fertilitate. Viitoarele tratamente genetice sunt luate în considerare pentru prevenirea bolilor ereditare, de exemplu trisomia 21 se datorează neexprimării unei gene responsabile de inactivarea cromozomului X în timpul fertilizării. Cu toate acestea, apar întrebări bioetice cu privire la procesarea ADN-ului pentru procreare.
Secvențierea cu randament ridicat a intrat și în domeniul microbiologiei medicale. În bacteriologie, de exemplu, chiar dacă aceeași specie bacteriană (de exemplu Staphylococcus aureus ) poate fi găsită în două probe de la pacienți diferiți, aceasta nu este neapărat o transmisie directă de la pacient la pacient. Într-adevăr, sub aceleași specii bacteriene sunt grupate multe tulpini foarte diferite și astfel au genomi diferiți. Secvențierea întregului genom face posibilă, de exemplu, determinarea cât de diferite sunt aceste genomi prin cuantificarea numărului de mutații ( SNP ) între organisme. În timpul transmiterii directe a unei bacterii de la un pacient la altul, numărul mutațiilor diferenței este, prin urmare, foarte scăzut.
În general, secvențierea cu randament ridicat a genomilor bacterieni întregi poate fi utilă pentru:
ADN-ul unei persoane poate fi transferat prin contact către obiecte sau către oameni. Acest ADN provine din celule din diferite matrice, sânge, spermatozoizi, elemente de păr, celule epiteliale. (Secvențierea ADN poate fi utilizată cu metode de profilare a ADN pentru identificarea criminalistică și testarea paternității. Totuși, trebuie remarcat faptul că un test de paternitate nu are nicio valoare legală în Franța. Numai dacă a fost dispus de un judecător.