Un cip ADN este o colecție de molecule ADN atașate în rânduri ordonate pe o suprafață mică care poate fi sticlă , siliciu sau plastic . Această biotehnologie recentă face posibilă analiza nivelului de expresie a genelor ( transcripții ) într-o celulă , un țesut, un organ, un organism sau chiar un amestec complex, la un moment dat și într-o stare dată în raport cu un eșantion de referință.
Cipurile ADN se mai numesc cipuri genetice , biocipuri sau prin termenii englezi „ cip ADN, ADN-microarray, biocip ” . Termenii francezi DNA microarray și DNA microarray sunt, de asemenea, termeni propuși de Office québécois de la langue française .
Principiul cipului ADN se bazează pe proprietatea ADN-ului denaturat (monocatenar) de a-și reforma spontan dubla spirală atunci când se află în prezența unei catene complementare ( reacție de hibridizare ). Cele patru baze nucleice ale ADN-ului ( A , G , C , T ) au într-adevăr particularitatea asocierii două la două prin legături de hidrogen (A = T și T = A; G ≡ C și C ≡ G).
Vorbim de sondă (fragment de ADN sintetic reprezentativ pentru genele a căror expresie dorim să o studiem, fixată covalent pe suprafața biocipului) și de țintă (ARNm pe care căutăm să-l identificăm și / sau cuantificăm (eșantionul)). Țintele sunt etichetate fluorescent (vezi mai jos).
Microarrays-urile pot fi utilizate pentru măsurarea / detectarea ARN-urilor care vor fi sau nu traduse în proteine. Oamenii de știință vorbesc despre analiza expresiei sau profilul expresiei . Deoarece este posibil să atașați până la un milion de sonde pe un biocip, microarrays-urile de ADN constituie o abordare masivă și au contribuit la revoluția în genomică , deoarece permit într-un singur experiment să aibă o estimare a expresiei a câteva zeci de mii de gene. Dar există, de asemenea, un număr mare de aplicații diferite care implică tehnologia cipului ADN (screening pentru mutații, resecvențiere, interacțiuni ADN / proteine, ecologie microbiană).
În practică, ARN-urile totale sunt extrase din celulele studiate și uneori suferă amplificare, ceea ce va face posibilă obținerea unei cantități suficiente de material genetic pentru experiment. Acești ARNm sunt apoi transformați în ADN-uri complementare (ADNc) prin tehnica de transcripție inversă și etichetați. Această etichetare este acum asigurată de o moleculă fluorescentă ( fluorocrom ). Există două fluorocromi utilizați în mod predominant: Cianina 3 (Cy3) care fluorescă în verde și Cianina 5 (Cy5) care fluorescă în roșu. Țintele astfel marcate (ADNc) sunt apoi aduse în contact cu cipul (care transportă toate sondele pe suprafața sa), acest pas se numește hibridizare. Fiecare catenă de ADNc se va hibridiza apoi cu sondele care îi sunt complementare pentru a forma un duplex sondă / țintă dublu catenar. Biocipul este apoi spălat în băi specifice pentru a îndepărta șuvițele de ADNc care nu s-au hibridizat deoarece nu sunt complementare sondelor fixate pe lamă. Biocipul va fi apoi analizat printr-un scaner cu rezoluție foarte înaltă, la lungimea de undă de excitație a cianinei 3 sau a cianinei 5. Imaginea scanată este apoi analizată de computer pentru a asocia o valoare d intensitate la fiecare sondă atașată biocipului și astfel se determină dacă a existat hibridizare pentru fiecare sondă.
În timpul unui experiment de biocip ADN care vizează compararea expresiei genelor între două condiții (de exemplu: celulă sănătoasă versus celulă bolnavă), ARN-urile totale ale celor două populații de celule sunt extrase și fiecare etichetată cu un fluorocrom diferit. Cele două probe sunt apoi depuse simultan pe biocip, aceasta se numește hibridizare competitivă. Pentru o anumită genă, dacă numărul moleculelor de ADNc corespunzătoare acestei gene este mai mare într-o condiție decât în cealaltă, va fi favorizată hibridizarea dintre aceste ADNc și sondele asociate. Astfel, după ce a scanat biocipul la cele două lungimi ale celor doi fluorocromi utilizați, este posibil să se compare intensitatea semnalului verde cu semnalul roșu și, prin urmare, să se cunoască pentru fiecare genă studiată în ce stare este cel mai exprimat.
Începuturile microarrays-urilor de ADN au început în 1991 cu o publicație a lui Stephen Fodor (om de știință american și fondator al companiei Affymetrix ) despre tehnologia de sinteză in situ . Urmează apoi câteva evenimente care intră în joc:
Există două tipuri de analize biochip:
Unul dintre punctele forte ale biocipului cu un singur canal este că o probă aberantă nu afectează analiza altor probe. În schimb, în biocipurile cu două canale, un singur eșantion de calitate slabă este suficient pentru a reduce drastic calitatea rezultatelor, chiar dacă celălalt eșantion țintă este perfect. O altă forță este că datele de la un biocip cu un singur canal sunt mai ușor comparate cu alte biocipuri din diferite experimente. În plus, biocipul cu un singur canal este uneori singura soluție posibilă pentru anumite aplicații.
Următorul tabel este preluat de pe pagina Wikipedia engleză .
| Denumirea procesului sau a tehnologiei | Descriere |
|---|---|
| Expresia genelor | Aceasta este cea mai cunoscută utilizare a cipului ADN. Expresia genelor este comparată între diferite condiții date sau în timp. Prin hibridizare și analiza ulterioară a imaginii, acest proces identifică genele care sunt supra sau sub-exprimate într-o stare dată. Odată ce aceste gene au fost identificate, sunt necesare analize ulterioare in silico, cum ar fi analize de grupare pentru a grupa gene cu același profil de expresie. În cele din urmă, rezultatele vor fi adesea confirmate genă cu genă prin metode precum PCR cantitativă sau Northern Blot. (metode de analiză genică) |
| Imunoprecipitarea cromatinei | Biocipurile pot utiliza, de asemenea, fenomenul imunoprecipitării cromatinei (imunoprecipitarea cromatinei pe Chip sau ChIP-On-Chip ). Această metodă face posibilă determinarea localizării situsului de legare a proteinelor în genom. |
| Polimorfism | Cipul ADN poate face posibilă și detectarea polimorfismului, adică identificarea polimorfismelor punctuale ale alelelor dintr-o populație sau între populații, prezicerea dezvoltării bolilor în cadrul unei populații, evaluarea mutațiilor sau analiza legăturilor dintre gene. |
| Gresie | Aceste jetoane sunt dedicate căutării de transcrieri noi (termenul „genă transcrisă” se înțelege). Adică, fiecare segment al cromozomului (nu doar genele cunoscute) este vizat de o sondă. Unul dintre interese este de a descoperi un număr mare de ARN-uri necodificate (cum ar fi ARN-urile lungi necodificate, de exemplu). Este astfel posibilă cartografierea cu succes a transcrierilor, căutarea exonilor sau chiar căutarea factorilor de transcriere . |
| Biocip genetic chimeric | Există, de asemenea, biocipuri cu o genă himerică (sau genă de fuziune). Principiul din spate este cel al îmbinării alternative în engleză sau al îmbinării alternative în franceză. Un astfel de biocip poate detecta apoi gene transcrise prin fuziune, deci din specimene de cancer. |
| Hibridare genomică comparativă | Un cip de hibridizare genomică comparativ este un cip ADN utilizat pentru a analiza modificările numărului de copii din ADN. Această tehnică este utilizată în principal pentru diagnosticarea cancerelor și a bolilor genetice. |
| GeneID | Aceste cipuri de ADN sunt utilizate pentru a detecta anumite tipuri de organisme din alimente (cum ar fi OMG-urile ), micoplasmele din cultura celulară sau anumiți agenți infecțioși pentru diagnosticarea bolilor. Tehnica se bazează în principal pe reacția în lanț a polimerazei . |
Lista de mai jos nu este intenționată să fie exhaustivă, dar oferă o imagine de ansamblu asupra domeniilor de aplicare a biocipurilor.
Cipul este o lamă, în general realizată din sticlă, de dimensiuni aproximativ mici (6 cm x 3 cm ), pe care sunt atașate sonde complementare unui fragment de acid nucleic (ADN sau ARN) vizat. Până la un milion de sonde pot fi atașate la un cip, permițând astfel analiza mai multor zeci sau chiar sute de mii de gene.
Ce tipuri de sondă să puneți pe cip?
| Oligonucleotide | Sonde lungi | |
|---|---|---|
| A tăia | 15 - 70 de mări | > 100 de mări |
| Beneficii | - detectarea SNP (polimorfism)
- Livrat „gata de depistat” |
- Insensibil la alele / variante
- Producție în cantitate mare - Colecții disponibile (EST, BAC ...) - Dublu catenar, mai multe opțiuni de etichetare, o acoperire mai bună a genomului |
| Dezavantaje | - Sensibil la alele / variante
- Costul producției în serie - Proiectarea oligo este un pas complex |
- Rezoluție mai mică
- Producția de produse PCR este grea - Problemă de hibridizare încrucișată - Erori de colecție (EST) |
Ce tipuri de gene sunt implicate?
În sine, nu există nicio contraindicație cu privire la tipul de gene de testat (gene cu funcții cunoscute sau necunoscute). Cu toate acestea, pentru a putea obține informații fiabile din experimentele de biocip, este recomandabil să includeți sonde de control pozitive și negative pentru a verifica și controla progresul corect al fiecărei etape a experimentului.
Această metodă utilizează sonde lungi (aproximativ o sută de nucleotide) depuse pe lamă. Sondele sunt sintetizate înainte de a fi depuse la suprafață în rânduri de picături mici sau pete (de unde și termenul englezesc microarray , „microtableau”). Folosim ace fine controlate de un braț robot care este scufundat în pete. Ace vor injecta apoi sondele în exces în fiecare loc. "Grila" finală reprezintă profilurile de acid nucleic ale sondelor preparate și fiecare sondă este gata să se hibridizeze cu țintele.
Această metodă este cea mai simplă, ceea ce face această soluție mai accesibilă laboratoarelor academice . Este folosit de oamenii de știință și cercetători din întreaga lume pentru a produce jetoanele potrivite nevoilor lor. Jetoanele sunt personalizate cu ușurință pentru fiecare experiment, deoarece cercetătorii pot alege tipul și locația sondelor sau chiar sintetiza singure sondele.
Oamenii de știință își pot genera apoi propriile probe țintă, utilizate pentru hibridizare cu sondele, pentru a analiza în cele din urmă cipurile cu propriul echipament. Acesta oferă un cip care este mai ieftin (evitând costul achiziționării de jetoane comerciale) și, de asemenea, potrivit cerințelor acestora.
Chipsurile care sunt realizate în acest mod, totuși, nu pot avea aceeași densitate de sonde ca chipsurile realizate prin sinteză in situ .
Aceste cipuri sunt realizate prin sintetizarea sondelor mici de ADN (<80-mer) direct pe suport (biocip) prin sinteză chimică.
O imagine de înaltă rezoluție este obținută folosind scanere de înaltă rezoluție (de ordinul unui micrometru) care dezvăluie interacțiunile sondă / țintă prin excitația fluorocromilor transportați de ținte. În Franța, compania INNOPSYS dezvoltă, produce și comercializează o gamă completă de scanere fluorescente dedicate citirii și analizei acestui tip de diapozitiv: InnoScan 710 (2 culori, 3 µm / pixel, InnoScan 710-IR, InnoScan 910 (2 culori , 1 µm / pixel) și InnoScan 1100 (3 culori, 0,5 µm / pixel).
Software-ul interpretează intensitatea pixelilor din imagine pentru a deduce o măsurare digitală a expresiei fiecărei gene.
Volumele mari de date sunt generate de analiza unui cip ADN și multe tehnici sunt utilizate pentru a interpreta rezultatele experimentului. Aceste tehnici includ: