Pierderea fluorescenta in fotooxidare induse , mai frecvent cunoscut prin acronimul FLIP (pentru Fluorescence Pierderea indusă de fotooxidare ) este o tehnica de microscopie de fluorescenta este folosit pentru a observa mișcarea moleculelor în interiorul celulei și membranele . În general, „ etichetăm ” o membrană celulară cu un colorant fluorescent pentru a vizualiza ceea ce vrem să observăm. O zonă specifică a acestei părți etichetate este apoi „ albită ” de mai multe ori folosind fasciculul unui laser de la un microscop confocal . După fiecare scanare a microscopului, decolorarea are loc din nou. Acest proces se repetă de mai multe ori pentru a se asigura că toți fluorocromii accesibili sunt decolorați, deoarece fluorocromii nealbiți sunt schimbați cu fluorocromi decolorați, provocând mișcare peste membrana celulară. Cantitatea de fluorescență din această regiune este apoi măsurată pe o perioadă de timp pentru a determina rezultatele fotoblanșării întregii celule.
Înainte ca fotoblanșarea să poată avea loc, o proteină fluorescentă trebuie injectată în celule (de obicei se folosește GFP ), ceea ce va permite proteinelor vizate să fluorescă și astfel să le poată urmări în timpul procesului. Apoi, trebuie să definim o regiune de interes; această regiune inițială de interes conține în general întreaga celulă sau mai multe celule. În FLIP, fotoblanșarea are loc chiar în afara acestei regiuni de interes, prin urmare trebuie să fie definită și o regiune de albire foto. În cele din urmă, trebuie să determinăm o a treia regiune, cea în care se va face măsurarea. Ar trebui făcute o serie de scanări inițiale pentru a identifica fluorescența înainte de albirea foto. Aceste scanări vor servi drept controale cu care vor fi comparate scanările fotoblanate. Ca urmare, fotoblanșarea poate avea loc în cele din urmă. Între fiecare „puls” de albire, este necesar să se acorde timp materialului fluorescent să revină la starea sa inițială. De asemenea, este important să faceți mai multe scanări ale regiunii de interes imediat după fiecare impuls de înălbire pentru un studiu aprofundat suplimentar. Schimbarea nivelului de fluorescență în regiunea de interes poate fi apoi cuantificată în trei moduri diferite. Cel mai frecvent este alegerea locației, dimensiunii și numărului de regiuni de interes pe baza inspecției vizuale a grupurilor de imagini disponibile. Celelalte două, mai recente, dar mai fiabile, constau fie în detectarea zonelor cu mobilitate diferită a sondei pe baza unei imagini individuale, fie în modelarea fizică a pierderii fluorescenței din corpurile în mișcare.
Pierderea fluorescenței este definită de fracția mobilă sau fracțiunea de fluorocromi capabili să revină la starea lor inițială într-o zonă fotoblanjită, a proteinei marcate cu fluorescență. Pierderea incompletă a fluorescenței indică faptul că există fluorocromi care nu se mișcă sau care tranzitează către zona albită. Acest lucru face posibilă identificarea fracției imobile sau a fracțiunii fluorocromilor incapabili să revină la starea inițială într-o zonă fotoblanjită, a proteinelor marcate cu fluorescență. Imobilitatea indică faptul că există proteine care pot fi în compartimente izolate de restul celulei, împiedicându-le să fie afectate de fotoblanșarea repetată.
Utilizarea inițială a FLIP este de a determina continuitatea organitelor cu membrană. Această continuitate (sau absența acesteia) este determinată de observarea cantității de fluorescență în regiunea de interes. Dacă există o pierdere completă a fluorescenței, acest lucru indică faptul că organitele sunt continue. Cu toate acestea, dacă există o pierdere incompletă a fluorescenței, atunci nu există continuitate între organite. În schimb, aceste organite sunt apoi compartimentate și astfel izolate de transferul tuturor fluorocromilor fotoblanși. Continuitatea aparatului Golgi , a reticulului endoplasmatic și a nucleului a fost verificată folosind FLIP.
Alte două utilizări mai puțin frecvente ale FLIP sunt pentru a determina modul în care proteinele sunt transportate din citoplasmă către nucleu și apoi pentru a determina rata la care are loc acest transport. Pentru a determina ce porțiuni sunt implicate în acest transport și când, sunt observate scanări continue. Cu cât o parte a citoplasmei este utilizată mai repede în procesul de transport, cu atât mai repede se va observa o pierdere completă a fluorescenței. Imaginea rezultată a acestui proces ar trebui să fie o citoplasmă complet albită. Dacă celula participă, de asemenea, la exportul de la nucleu la citoplasmă, fotoblanșarea va avea loc și în nucleu.
Rata de schimb între nucleu și citoplasmă poate fi, de asemenea, determinată din acest tip de date. În aceste exemple, regiunea de albire foto se află în nucleu. Dacă transportul are loc într-un ritm rapid, nivelurile de fluorescență din compartimentele nucleare vor scădea rapid la cadrele selectate. Cu toate acestea, dacă transportul are loc într-un ritm lent, nivelurile de fluorescență vor rămâne aceleași sau vor scădea doar foarte puțin.
FLIP este adesea utilizat în strânsă asociere cu FRAP (redistribuirea fluorescenței după albire foto). Diferența majoră dintre aceste două tehnici de microscopie este că FRAP implică studiul abilității unei celule de a se recupera de la un singur eveniment de albire foto în timp ce FLIP implică studiul modului în care pierderea fluorescenței se răspândește prin celulă după mai multe evenimente de albire albă. Această diferență de focalizare duce, de asemenea, la o diferență în părțile celulei pe care le observăm. În FRAP, zona care este cu adevărat fotoblanșată corespunde zonei de interes. Dimpotrivă, în FLIP, regiunea de interes se află chiar în afara regiunii care este albă fotocalizat. O altă diferență importantă este că în FRAP există un singur eveniment de albire foto, precum și o perioadă de recuperare, pentru a observa cât de eficient se întorc fluorocromii la locul albit; întrucât în FLIP, au loc mai multe evenimente de albire foto pentru a preveni întoarcerea fluorocromilor nealbiți în regiunea de înălbire. La fel ca FLIP, FRAP este utilizat în studiul continuității organelor cu membrană. Aceste două tehnici sunt adesea utilizate împreună pentru a determina mobilitatea proteinelor marcate cu GFP. FLIP poate fi, de asemenea, utilizat pentru a măsura transferul molecular între regiunile unei celule, indiferent de rata de mișcare. Acest lucru permite o analiză mai aprofundată a traficului de proteine în interiorul unei celule. Acest lucru diferă de FRAP, care este util în primul rând pentru determinarea mobilității proteinelor numai în regiunile în care are loc fotoblanșarea.
Există mai multe complicații implicate atât cu FLIP, cât și cu FRAP. Deoarece aceste două tehnici de microscopie observă celulele vii, există întotdeauna posibilitatea ca celulele să se miște, ceea ce distorsionează rezultatele. Cel mai bun mod de a evita acest lucru este să folosiți un algoritm de aliniere, care va compensa fiecare mișcare și va elimina o mare parte a erorii datorate mișcării. În aceste experimente este, de asemenea, esențial să existe un grup de control pentru a ajusta rezultatele și a corecta curba de recuperare pentru pierderea globală de fluorescență. O altă modalitate de a minimiza eroarea este de a restricționa albirea foto la o singură regiune sau zonă. Această limitare va juca rolul de control și va limita pierderea de fluorescență datorată foto-deteriorării în comparație cu pierderea de fluorescență datorată albirii foto.