Electroforeza pe gel de agaroză este o metodă utilizată în biochimie și biologie moleculară pentru a separa ADN - ul , ARN sau proteine în funcție de greutatea moleculară .
Tehnica electroforezei pe gel de agaroză se bazează pe separarea acizilor nucleici încărcați negativ sub efectul unui câmp electric . Această separare are loc prin matricea gelului de agaroză : moleculele de dimensiuni mai mici se mișcă mai repede și vor migra mai departe decât moleculele de dimensiuni mai mari.
Avantajele electroforezei pe gel de agaroză sunt următoarele:
Cel mai important factor este lungimea moleculei de ADN: separarea are loc în funcție de masa moleculară și, prin urmare, de dimensiunea ADN-ului. Cu toate acestea, conformația ADN este, de asemenea, un factor important. Astfel, pentru a evita problemele asociate acestei conformații, numai ADN liniar este separat pe gel de agaroză (fragment de ADN rezultat din digestie, ADN amplificat prin PCR sau chiar ADNc ).
Creșterea concentrației de agaroză într-un gel reduce rata migrației și permite separarea fragmentelor de ADN mai mici. Cu cât tensiunea este mai mare, cu atât crește viteza de migrare. Cu toate acestea, tensiunea este limitată ca intensitate, într-adevăr o tensiune ridicată induce o creștere a temperaturii care poate topi gelul.
Conformația ADN-ului plasmidic, care nu este digerată de o enzimă de restricție , migrează la viteze diferite (de la cea mai lentă la cea mai rapidă): ADN circular , ADN liniar și ADN supraînfășurat .
Un gel 1% g / v ( 1 g de agaroză la 100 ml de volum final) este utilizat în general în electroforeză . Cu cât vrei mai mult un gel discriminant, cu atât vei crește procentul de agaroză.
Agaroza este un polimer pe bază de agar purificat. Diferite purități de agaroză sunt disponibile de la furnizori. În general, agaroză cu solidificare lentă, de înaltă puritate, este utilizată atunci când ADN-ul trebuie extras din gel după migrare.
Există un număr foarte divers de tampoane. Cele mai frecvent utilizate sunt Tris / Acetat / EDTA ( TAE ), Tris / Borat / EDTA ( TBE ) și boratul de sodiu (SB).
TAE are cea mai mică capacitate de tamponare, dar produce o separare mai bună pentru fragmente mari de ADN.
SB este relativ nou și ineficient pentru separarea fragmentelor de ADN mai mari de 5000 de perechi de baze ( 5 kb ). Cu toate acestea, conductivitatea sa scăzută permite utilizarea unei tensiuni mai mari (până la 35V / cm), ceea ce reduce considerabil timpul de migrare.
Fragmentele de ADN cu doar câteva perechi de baze de diferențe sunt separate folosind un gel de agaroză 3% și cu un tampon SB cu conductivitate foarte scăzută ( 1 mM borat de litiu).
Exemplu pentru un mini-gel de 50 ml destinat separării fragmentelor de 2 până la 6 kb
Concentrația de agaroză (% în m / V ) | Gama de dimensiuni ideale (în kb ) |
---|---|
0,3 | 5 - 60 |
0,6 | 1 - 20 |
0,7 | 0,8 - 10 |
0,9 | 0,5 - 7 |
1.2 | 0,4 - 6 |
1.5 | 0,2 - 3 |
2.0 | 0,1 - 2 |
Pentru a vizualiza migrarea electroforezei, este mai întâi necesar să adăugați un colorant la gel la o concentrație prescrisă de producătorul agentului de intercalare sau să efectuați o vizualizare post-migrare. Cea mai utilizată metodă de revelare este revelația cu bromură de etidiu sau BET. Bromura de etidiu este un agent intercalant utilizat în mod obișnuit ca marker al acidului nucleic în laboratoarele de biologie moleculară . Când este expus la radiații ultraviolete , acesta fluorescă cu o culoare roșu-portocalie, de 20 de ori mai intensă atunci când este legată de ADN . Acest efect s-ar datora creșterii hidrofobiei mediului, mai degrabă decât unei rigidizări a inelului benzenic , acesta din urmă nefiind situat între perechile de baze . Cu toate acestea, bromura de etidiu este toxică și extrem de mutagenă și trebuie manipulată cu mare atenție. Se pot utiliza și alți agenți intercalatori mai siguri, cum ar fi GelRed, SYBR Safe, violet de gențiană și albastru de metilen.
GelRedGelRed este un colorant fluorescent folosit pentru vizualizarea pe geluri de agaroză sau poliacrilamidă a ADNs, ADNs sau ARN. Are caracteristicile de a fi foarte specific, foarte stabil și respectând mediul. În plus, sensibilitatea sa este superioară bromurii de etidiu și nu necesită pași de albire.
1. Adăugați GelRed la agaroză topită pentru o concentrație finală de 1X.
2. Se toarnă gelul și se continuă cu migrarea.
3. Vizualizați migrarea cu un dispozitiv UV.
SYBR sigurSYBR Safe este o pată cu gel de agaroză sau poliacrilamidă cu sensibilitate ridicată. Acționează ca un intercalator pentru ADN și ARN. Producătorul vinde produsul la o concentrație deja gata de utilizare. Vizualizarea migrației se poate face prin excitarea agentului cu raze UV sau chiar cu lumină albastră.
Violet de gențianăVioleta de gentiană poate fi utilizată ca agent de vizualizare pentru electroforeza pe gel de agaroză. Este necesar să aveți o concentrație mare de ADN (100 ng și mai mult) pentru a migra, având în vedere sensibilitatea redusă a acestei metode. Comparativ cu bromura de etidiu, acest colorant ar trebui adăugat la o concentrație de 10 µg / ml în gel, precum și în tamponul de rulare pentru a obține rezultate adecvate. Pentru a crește sensibilitatea metodei, este mai întâi posibilă decolorarea gelului în apă după migrarea completă. Apoi, se recomandă efectuarea unei a doua colorări într-un volum mare de 0,1X TAE tampon conținând 10ug / ml de violet de gențiană la sfârșitul migrației.
Albastru de metilAlbastrul de metilen poate fi folosit ca dezvoltator la sfârșitul migrației pe gel de agaroză sau poliacrilamidă. Această metodă necesită un timp de colorare de până la 15 ore, având în vedere sensibilitatea sa scăzută. Avantajul său este pur și simplu că permite să nu se utilizeze bromură de etidiu și că decolorarea acestuia necesită doar apă distilată. Cu toate acestea, utilizarea acestui colorant induce o colorare a fundalului care este dificil de îndepărtat și acest lucru face vizualizarea benzilor mai dificilă.
Alternativ, gelul poate fi incubat într-o baie care conține SYBR Green I (pentru acizi nucleici dublu catenari) sau SYBR Green II (pentru a detecta, de asemenea, acizi nucleici monocatenari). SYBR Green are avantajul de toxicitate mai scăzută și o sensibilitate mai mare pentru a detecta cantități mai mici de acizi nucleici.
Teoretic, electroforeza pe gel de agaroză permite separarea fragmentelor de ADN de la 50 de perechi de baze la câteva milioane. Cu toate acestea, este utilizat în general pentru separarea fragmentelor de dimensiuni cuprinse între 100 bp și 20 kbp . Timpul mediu de migrare este de o oră.
Fragmentele de acid nucleic mai mici sunt cel mai bine separate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă . Fragmentele de dimensiuni mari sunt mai greu de separat. În general, utilizarea gelului de agaroză la o concentrație mare (3 până la 4%) este atunci necesară pentru fragmente mai mici de 150 bp , deoarece permite o mai bună separare și rezoluție a diferitelor benzi în funcție de diferența de mărime a acestora. Principalul dezavantaj este timpul de migrare, care poate dura până la câteva zile. Pentru a depăși aceste probleme, este avantajos să efectuați electroforeză cu câmp pulsat sau, alternativ, electroforeză cu câmp invers.
După migrarea electroforezei, gelul este iluminat sub lumină ultravioletă pentru a observa benzile de ADN fluorescente. Benzile pot fi apoi tăiate și separate de gel, apoi dizolvate pentru a recupera ADN-ul purificat. Mărimea fragmentelor este estimată prin comparație cu scala markerului de dimensiune moleculară (ADN-scară) utilizată simultan într-un alt puț în timpul migrației.
Gelul este de obicei fotografiat cu o cameră digitală. Deși culoarea ADN-ului fluorescent este roșu-portocaliu, fotografiile sunt publicate în alb și negru (a se vedea diagrama de mai jos).
Gelurile de electroforeză utilizate pentru publicații sunt de cele mai multe ori analizate folosind software de calculator, precum ImageJ .
1 | 2 | 3 |
---|---|---|