Descrisă prima dată în 2009, transcriere activator-like efector nucleazei s (Talens, transcriere activator-like nucleaze efectoare ) sunt artificiale enzime de restricție generate de fuziune a unui domeniu de legare ADN , numit TALE, cu un domeniu care are capacitatea de a alipi ADN - ului .
Cele enzime de restricție sunt enzime care au capacitatea de a tăia ADN la o secvență specifică. Transcriere activator-like efectori (Tales, activatorul-like transcriere efectorilor) pot fi proiectate rapid pentru a atașa la aproape orice secvență de ADN dorită. Prin combinarea unui domeniu TALE cu un domeniu de clivaj ADN (care va tăia catena ADN), se pot crea astfel enzime de restricție specifice pentru orice secvență ADN. Când aceste enzime sunt introduse în celule, ele pot fi apoi utilizate pentru a modifica genomul in situ .
Efector TAL (BASM) sunt proteine secretate de bacteria Xanthomonas . Domeniul de legare a ADN-ului constă din repetări de 33 sau 34 de aminoacizi identici cu excepția aminoacizilor 12 și 13. Aceste două reziduuri sunt foarte variabile și prezintă o corelație puternică cu recunoașterea unui nucleotid specific. Această relație simplă între secvența de aminoacizi și recunoașterea ADN permite crearea domeniilor de legare ADN specifice secvenței prin selectarea unui ansamblu de segmente repetate care conțin reziduurile variabile adecvate.
Domeniul de scindare ADN nespecific al endonucleazei Fok1 poate fi utilizat pentru a construi nucleaze hibride care s-au dovedit a fi eficiente în testele de drojdie. Aceste proteine sunt active și în celulele vegetale și animale. Primele studii pe TALEN au fost efectuate cu domeniul original al Fok1, dar abordările mai recente utilizează domenii care poartă mutații special concepute pentru a crește specificitatea și eficiența clivajului ADN-ului. Domeniile Fok1 funcționează ca un dimer , care necesită două construcții cu domenii de legare a ADN direcționate împotriva siturilor din genom cu orientări cap-coadă și distanțare corectă. Numărul de aminoacizi dintre domeniul TALE și domeniul Fok1, precum și numărul de baze între cele două situsuri de legare de pe genom sunt doi parametri importanți pentru asigurarea unei bune activități a enzimei himerice.
Relația simplă dintre secvența de aminoacizi și secvența de ADN recunoscută de domeniul de legare a ADN permite sinteza proteinelor personalizate. În cazul TALEN-urilor, sinteza artificială a genei care codifică enzima este problematică, deoarece secvențele repetate ale domeniului de legare a ADN-ului riscă să se hibridizeze între ele în timpul etapelor de sinteză a oligonucleotidelor . Una dintre soluțiile pentru a depăși această problemă este utilizarea software-ului deschis publicului ( DNAWorks ) pentru a determina oligonucleotidele adecvate pentru asamblare cu două etape PCR urmate de amplificarea întregii gene. Au fost concepute și alte câteva proceduri pentru asamblarea domeniilor TALE.
Odată ce genele care codifică TALEN au fost asamblate, acestea sunt inserate în plasmide . Plasmidele sunt apoi utilizate pentru a transfecta celulele dorite unde proteina TALEN va fi apoi exprimată și va trece în nucleu pentru a accesa genomul. TALEN-urile pot fi, de asemenea, livrate către celulă sub formă de ARNm, ceea ce elimină posibilitatea integrării genomice a genei care codifică TALEN.
TALEN-urile pot fi utilizate pentru a face modificări ale genomului prin capacitatea lor de a induce rupturi de ADN dublu catenar (DSB), la care celulele răspund prin mecanisme de reparare a ADN-ului . Repararea non-omologă a îmbinării finale (NHEJ) permite reconectarea a două capete de ADN rezultate dintr-o pauză dublu-catenară atunci când nu este disponibilă nicio secvență complementară care să servească drept model pentru reparații. Acest mecanism de reparare induce erori în genom prin inserții și / sau ștergeri; precum și rearanjamente cromozomiale. Este posibil ca toate aceste erori să facă produsul genetic codificat la acest locus să nu fie funcțional. Deoarece activitatea enzimei poate varia în funcție de specie, tipul celulei, gena țintă și nucleaza utilizate, acești parametri trebuie luați în considerare la proiectarea TALEN și trebuie luată în considerare generarea mutațiilor. Un experiment simplu de clivaj heteroduplex poate detecta diferențele dintre două alele amplificate de PCR. Produsele de scindare pot fi vizualizate pe un gel de agaroză . Alternativ, ADN-ul poate fi introdus în genom profitând de NHEJ având grijă să furnizeze o sursă de ADN exogenă .
Recombinarea omologă poate permite, de asemenea, introducerea ADN-ului străin la locul rupturii, ADN-ul dublu catenar transfectat putând fi utilizat de către enzimele de reparație ca șablon.
TALEN-urile au fost folosite pentru a genera celule stem embrionare umane și celule iPS modificate genetic , dar și pentru a genera eliminări în diferite organisme, cum ar fi C. elegans , șobolani, șoareci sau chiar pești zebră . De asemenea, s-a demonstrat că utilizarea a două perechi de TALEN permite modificări simultane ale a două gene în același timp. Foarte recent, această tehnică poate fi utilizată și pentru a genera knock-in-uri . Astfel, TALEN-urile au fost injectate în ovocitele de șobolan, ceea ce a făcut posibilă generarea șobolanilor knock-in pentru receptorul glucocorticoid.
Dacă un TALEN nu este suficient de specific pentru site-ul său țintă sau nu vizează o secvență unică din genomul de interes, pot apărea clivaje nedorite. Acest tip de artefact poate provoca destule pauze dublu catenare pentru a copleși mașinile de reparare a ADN-ului , rezultând rearanjări cromozomiale sau chiar moartea celulelor . Aceste clivaje nespecifice pot avea loc, de asemenea, cu alte nucleaze artificiale, cum ar fi nucleaze deget de zinc , al căror efect nespecific este mai bine caracterizat.