Focusare izoelectrică (IEF izoelectrică engleză focalizare sau electrofocusing) este o tehnică de separare a moleculelor , cum ar fi proteinele , prin diferențele lor la punctul izoelectric . Este un tip de electroforeză a zonei.
Are aplicații pregătitoare și analitice. Este utilizat în principal în domeniul biochimiei. În esență, este utilizat pentru a separa proteinele unele de altele pe baza punctului lor izoelectric unic.
Deși cercetătorii Ikeda și Suzukion au fost primii care au observat că aminoacizii separați într-o proteină au format un gradient de pH atunci când sunt așezați între doi electrozi, biofizicianul rus Alexander Kolin este creditat cu cea mai mare contribuție la dezvoltarea focalizării izoelectrice. Pe baza noțiunilor deja aplicate electroforezei în timpul său, fostul profesor de la Universitatea din California din Los Angeles a dezvoltat focalizarea izoelectrică în 1954. Această tehnică este atât de strâns legată de electroforeză. Numită și electroforeză izoelectrică.
În plus, deși execuția acestei tehnici a fost destul de lungă și plictisitoare la începuturi la mijlocul anilor cincizeci, focalizarea izoelectrică astăzi este una dintre cele mai utilizate tehnici pentru separarea și caracterizarea proteinelor dintr-un amestec. Într-adevăr, datorită puterii sale de rezolvare de neegalat și compatibilității sale cu o gamă largă de metode de separare, electrofocalizarea este în prezent o metodă indispensabilă pentru oricine întreprinde studiul proteinelor.
Separările prin IEF se bazează pe proprietățile de încărcare ale moleculelor. După cum sa menționat în timpul introducerii, este mai ales punctul izoelectric unic al fiecărei molecule care este utilizat pentru a le separa și a le purifica dintr-un amestec. De fapt, punctul izoelectric este definit ca pH-ul specific în care o moleculă nu are sarcină electrică netă. Prin urmare, din acest motiv IEF se aplică în mod specific separării moleculelor amfotere care pot acționa atât ca acid, fie ca bază. Aminoacizii care formează proteinele fiind zwitterions , sunt „specii ionice care poartă simultan o sarcină pozitivă și o sarcină negativă”, tocmai din acest motiv focalizarea izoelectrică este utilizată în special pentru a proceda la separarea speciilor proteice de un amestec.
În timpul focalizării izoelectrice, prin introducerea unui curent electric este indusă migrarea speciei încărcate. Într-adevăr, se aplică o diferență de potențial între un anod și un catod pentru a migra moleculele încărcate pozitiv spre catod și cele încărcate negativ spre anod. Pe de altă parte, separarea moleculelor proteice de interes nu poate fi realizată în absența unui gradient de pH.
La un pH dat, adică când se atinge punctul izoelectric, proteinele se găsesc neapărat fără încărcare netă, ele încetând să migreze sub efectul câmpului electric indus. Deci, deoarece proteinele au toate un punct izoelectric diferit, ele se concentrează într-o zonă bine definită în care pH-ul gradientului este egal cu punctul lor izoelectric. Prin urmare, combinația gradientului de pH cu trecerea unui curent electric prin analit permite într-adevăr separarea polipeptidelor de acesta din urmă.
Deoarece gradientul de pH este un parametru cheie al focalizării izoelectrice, natura sa determină în mare măsură calitatea separării. Cele două modalități principale de a obține un gradient de pH sunt:
CapilarGradientul de pH este generat folosind o soluție tampon de mai mulți amfoliți având un punct izoelectric diferit supus unui curent electric. Trebuie remarcat faptul că „amfoliții sunt compuși amfoteri care conțin de obicei acid carboxilic și grupări amină”. În plus, este posibil să se pregătească în laborator aceste soluții apoase de amfoliți care acoperă diferite intervale de pH în funcție de moleculele care urmează să fie separate sau să le obținem comercial.
Cu această tehnică, analiții sunt dizolvați într-o soluție de amfoliți într-un tub capilar plasat între un catod, unde există un electrolit bazic, și un anod, unde există un electrolit acid. Odată ce tensiunea constantă este aplicată la bornele electrozilor, cationii, anionii și diferiții amfoliți migrează într-o parte sau alta a celulei de electroforeză, cea mai acidă la anod și cea mai bazică la catod, creând astfel o Gradient de pH în care analiții pot migra, până când ajung la o regiune de pH în care sarcina lor netă este zero. Diferitele analiți, de obicei de natură peptidică, încetează apoi migrarea, deoarece sarcina lor netă este zero și sunt apoi separați în funcție de punctul lor izoelectric.
Această metodă capilară face posibilă utilizarea unui câmp electric mai mare, deoarece îngustimea capilarului permite ca temperatura să scadă mai repede. Un câmp electric mai mare permite reducerea timpului de separare cu câteva minute. Această tehnică scade, de asemenea, răspândirea benzilor prin difuzie, ceea ce le face mai ascuțite. Cu toate acestea, permite doar separarea unei cantități mici de molecule. Electroforeza capilară are o rezoluție bună și poate fi automatizată, la fel ca cromatografia lichidă de înaltă performanță. Permite analiza unei cantități mai mari de molecule, putem analiza proteine, acizi nucleici, peptide, carbohidrați, cationi, anioni, vitamine, pesticide de viruși și chiar celule întregi.
Pe gelGradientul mobil de pH este generat în gelul de poliacrilamidă de către amfoliții legați de unitățile de acrilamidă, astfel încât să se creeze un gradient de pH pe tot gelul în timpul trecerii unui curent electric. Este un gel sintetic care poate fi achiziționat comercial.
Acest gel este preparat folosind amfoliți, care sunt purtători de sarcină și la fel ca proteinele, au puncte izoelectrice diferite. Un curent electric trebuie supus amfoliților pentru a obține un gradient de pH care crește către catod. Ulterior, sarcina netă pentru amfoliți va fi zero, deci moleculele nu se vor mai mișca și vom avea un gradient de pH imobil. Această tehnică de formare a gradientului pH oferă un gradient care este stabil pentru separarea moleculelor prin focalizare izoelectrică.
Amfoliții pot fi, de asemenea, legați de acrilamidă polimerizată pentru a crea un gel gradient pI imobilizat. Acest tip de gel evită o problemă care poate fi prezentă atunci când se utilizează focalizarea izoelectrică, și anume șuntul catodic, în care gradientul de pH se va descompune în timp. Prin urmare, această metodă de formare a gradientului permite o reproductibilitate mai mare și permite analiza unui număr mai mare de molecule în același timp, deoarece gradientul de pI este mai stabil. Un al doilea fenomen care poate schimba gradientul de pH și rezoluția este electroosmoza. Acest lucru se observă atunci când matrița sau o parte a echipamentului care este în contact direct cu gelul poartă o sarcină.
Cu această metodă de gel, proba lichidă care conține analiții poate fi introdusă oriunde pe gelul de poliacrilamidă, iar proteinele vor migra spontan spre anod sau catod până la atingerea punctului lor izoelectric, în prezența unui curent electric. Ca și în tehnica anterioară, proteinele vor fi apoi separate în funcție de punctul lor izoelectric.
Trebuie remarcat faptul că gelul poliacrilamidic este cel mai des utilizat în zilele noastre și că focalizarea izoelectrică este adesea cuplată cu electroforeza în gel 2D care permite o separare mai bună în funcție de greutatea moleculei.
Odată ce proteinele sunt separate în benzi în timpul IEF, este necesar să se detecteze diferitele proteine separate pentru a le analiza. Pentru a face acest lucru, se folosesc două tehnici pentru a conduce proteinele către detectorul situat la un capăt al capilarului:
Mobilizarea hidrodinamicăAceastă tehnică constă în aplicarea unei diferențe de presiune în direcția detectorului, astfel încât zonele focalizate să curgă către acesta. Trebuie remarcat faptul că această tehnică are ca efect amestecarea zonelor focalizate. Prin urmare, este destul de ineficient.
Mobilizarea chimicăAceastă tehnică constă în modificarea gradientului de pH în capilar prin adăugarea unei sări neutre la unul dintre cei doi electrozi, de exemplu la anod, care va avea efectul de a conduce benzile focalizate către detector la catodul în care va fi pH-ul coborât. Benzile cu un punct izoelectric ridicat vor fi detectate mai întâi.
În plus, atunci când se utilizează metoda IEF pe gel, se utilizează markeri colorați sau absorbție UV pentru a detecta proteinele separate. Trebuie remarcat faptul că amfoliții trebuie mai întâi eliminați din gel înainte de a continua cu etichetarea, altfel amfoliții vor fi, de asemenea, marcați.
Gelurile pentru focalizarea izoelectrică pot fi achiziționate sau făcute singure și există mai multe lungimi și variații pentru gradientul de pH care servește pentru a avea o separare mai bună în funcție de utilizare. Obținerea unui gel de la o companie specializată economisește timp și asigură, de asemenea, calitatea gelului. Pentru a alege un gel potrivit, iată câteva lucruri care vă pot ajuta:
Poliacrilamida este cea mai utilizată matrice pentru gelul de focalizare izoelectric. Cu toate acestea, se poate folosi și un gel de agaroză care permite pori mai mari, permite colorarea și decolorarea rapidă și nu este toxic, spre deosebire de poliacrilamida care provine din acrilamida, care este toxică. Gelul de agaroză este utilizat pentru electroforeza proteinelor și, de asemenea, a acizilor nucleici.
Pentru a preveni porozitatea de a afecta rata de migrație a proteinelor mici către cele mari, un gel cu o concentrație de acrilamidă de 5 până la 6 procente este satisfăcător, cu excepția proteinelor mari, unde trebuie utilizate concentrații de 5 până la 6 procente. Pe de altă parte, trebuie remarcat faptul că gelurile cu o concentrație de acrilamidă mai mică de 4% sunt foarte greu de manipulat, deoarece sunt foarte fragile. Pentru a remedia situația, este posibil să adăugați agaroză pentru a crește ușor rigiditatea matricei fără a influența mobilitatea proteinelor.
De asemenea, trebuie să se țină seama de afinitatea proteinelor pentru matricea utilizată, deci dacă o proteină are o afinitate mai mare, aceasta va migra mai puțin rapid decât alte proteine. O matrice precum poliacrilamida este mai inertă și, prin urmare, va avea mai puțină afinitate cu proteinele și, prin urmare, va permite o separare mai bună decât cu gelul de agaroză.
Alte matrice care sunt uneori folosite pentru focalizarea izoelectrică sunt hârtia, care nu este folosită cu adevărat în zilele noastre, acetat de celuloză și amidon. Pentru hârtie, care conține molecule de celuloză, este utilizată pentru a separa aminoacizii și alte molecule mici încărcate. Cu toate acestea, atunci când separați aminoacizii cu hârtie, acest lucru trebuie făcut la o tensiune foarte mare. Acetatul de celuloză este utilizat în principal pentru separarea proteinelor fără rezoluție mare. Rezoluția sa scăzută permite doar separarea grupurilor mari de proteine. Deși acetat de celuloză nu este scump și ușor de utilizat, este utilizat mult mai puțin decât agaroză. În cele din urmă, gelurile de amidon, care nu mai sunt folosite cu adevărat, sunt poroase și servesc, de asemenea, pentru separarea proteinelor.
Plăcuța anodică este un acid puternic, iar plăcuța catodică este o bază puternică. Acestea sunt adesea acid fosforic și trietanoamină .
După cum sa menționat anterior, amfoliții trebuie utilizați pentru a crea un gradient de pH. Acestea sunt un amestec de polielectroliti cu mase moleculare mici. Alegerea diferiților amfoliți face posibilă crearea unor gradienți de pH variați în funcție de punctul lor izoelectric adaptat în mod specific separării dorite. Într-adevăr, este posibil apoi să existe abateri de pH mai restrânse de o amplitudine mică de 0,1 unități pentru a diferenția mai bine proteinele care au puncte izoelectrice apropiate una de alta, pentru a crește precizia separării. În plus, pentru a face o analiză cu proteine cu diferite puncte izoelectrice, este posibil să se creeze un gradient pe un interval mai larg de pH cu intervale de la 2 la 10 și o separare de 0,4 unități de pH în loc de 0,1. În unele, este chiar posibil să se realizeze o separare a proteinelor având o diferență de punct izoelectric la fel de mică ca 0,001 unități de pH.
Există două modalități de a introduce proteine. Într-adevăr, este posibil să le introducem după stabilirea gradientului de pH cu amfoliții, precum și înainte. Acest lucru este posibil deoarece proteinele sunt mai mari decât amfoliții. Prin urmare, proteinele au un proces de migrație neapărat mai lent decât amfoliții, lăsându-le suficient timp pentru a se stabiliza pentru a crea gradientul de pH.
Pentru a efectua focalizarea izoelectrică asupra analiților, este necesar să aveți o celulă de electroforeză cu un anod și un catod pentru a introduce un curent electric pentru a stabili un gradient de pH în gelul de poliacrilamidă.
Trebuie remarcat faptul că, deși focalizarea izoelectrică este foarte asemănătoare cu electroforeza, are mai multe avantaje. În primul rând, timpul de focalizare este diferit în focalizarea izoelectrică comparativ cu electroforeza normală. Cu focalizarea izoelectrică, timpul de focalizare este mai puțin critic, deoarece proteinele nu pot ieși din gel, deoarece se opresc la pH unde vor fi atins punctul lor izoelectric. Prin urmare, este necesar ca migrarea să dureze suficient de mult pentru a permite amfoliților să se poziționeze corect pentru a crea un gradient imobil și ca proteinele să aibă timp să ajungă la punctul lor izoelectric, dar nu este nevoie să ne temem de pierderea analiților.
Este posibil să se determine pH-ul punctului izoelectric al proteinelor prin compararea distanței de migrație cu cea a proteinelor pure unde este cunoscut punctul izoelectric. De asemenea, utilizarea unui microelectrod de suprafață poate face posibilă determinarea pH-ului unde s-a imobilizat o proteină.
Pentru focalizarea izoelectrică, proteinele pot fi focalizate în forma lor denaturată sau în starea lor nativă. În starea lor nativă, proteinele sunt cel mai adesea studiate, deoarece în această stare, putem găsi mai multe forme diferite ale proteinei, în timp ce cu forma denaturată, vom vedea doar o bandă pe gel. Proteinele pot fi denaturate prin tratarea lor cu uree sau un agent de reducere a tiolului, de exemplu ditiotreitol (DTT), care va schimba proteina într-o polipeptidă și va crește, de asemenea, drastic solubilitatea proteinelor hidrofobe. Deci, în special proteinele care sunt hidrofobe vor fi denaturate înainte de a fi concentrate. Când proteinele sunt denaturate, ureea trebuie adăugată și la gel și în aceste condiții temperatura gelului trebuie să fie de 20 ° C pentru a evita formarea izocianatului din uree care ar influența rezultatele analizei.
După terminarea separării proteinelor prin pI-ul lor, este important să puteți observa benzile care s-au format. Pentru a face acest lucru, există câteva metode care vă permit să le vizualizați. Prima este colorarea cu diverși coloranți, cum ar fi albastru Coomassie, unde trebuie să fixăm gelul cu acid tricloracetic 20%, apoi colorăm gelul cu albastru Coomassie dizolvat în 40% metanol și 10% acid acetic, apoi decolorăm cu 25% metanol și 10% acid acetic. Colorantul verde solid FCF este un colorant care nu interferează cu amfoliții găsiți în gelul de focalizare izoelectric și oferă un domeniu de detectare mai bun decât albastrul Coomassie.
De asemenea, este posibil să se utilizeze un colorant fluorescent, cum ar fi fluorescamina, care se va lega cu grupările aminice primare ale peptidelor și va forma compuși foarte fluorescenți. Cu toate acestea, această metodă necesită un dispozitiv care să permită vizualizarea vopselei. Există, de asemenea, mai multe metode de colorare a argintului care pot fi utilizate. Pentru enzime, tehnica care poate fi utilizată este detectarea prin zimografie. Tehnica de colorare va depinde de tipul de matrice utilizată și, de asemenea, de moleculele studiate.
Până în prezent, markerii de tip fluorescent care emit diferite lungimi de undă sunt în plină expansiune.
Pentru a studia un număr mare de proteine în același timp, focalizarea izoelectrică este adesea combinată cu electroforeza denaturantă (gel SDS), care separă moleculele în funcție de greutatea lor moleculară. Această tehnică, electroforeza bidimensională (gel 2D) a fost introdusă de Patrick H. O'Farrell în 1975 și ar trebui să permită analizarea a maximum 5.000 de proteine. Utilizarea acestor două tehnici de separare permite o rezoluție excelentă, deoarece pI și greutatea moleculară a unei molecule nu depind una de cealaltă. Prima dimensiune a gelului 2D este întotdeauna focalizarea izoelectrică și ulterior gelul SDS.
Focalizarea izoelectrică poate fi combinată cu alte metode de separare decât gelul SDS care separă moleculele în funcție de greutățile lor moleculare. Majoritatea acestor alte metode separă, de asemenea, proteinele pe baza greutăților sau dimensiunilor lor moleculare.
De exemplu, gelul de focalizare izoelectric poate fi combinat cu un gel de acetat de celuloză sau un gel de electroforeză cu un gradient de pori. Acest din urmă gel permite proteinelor să fie separate în starea lor nativă în funcție de mărimea lor moleculară cu ajutorul unui gel în care dimensiunea porilor scade treptat datorită creșterii concentrației gelului.
În cele din urmă, focalizarea izoelectrică poate fi combinată cu imunoelectroforeza. Această combinație este utilizată în principal în imunologie și constă în luarea unei benzi de gel obținute cu focalizare izoelectrică și plasarea acestuia într-un gel care conține o soluție de anticorpi specifici, ceea ce va face ca proteinele să migreze în funcție de afinitatea antigenilor cu aceștia. anticorpi. Această tehnică a fost utilizată pentru analiza proteinelor urinare, a amilazelor salivare și a proteinelor serice umane.
Focalizarea izoelectrică este utilizată pentru analize clinice, de exemplu pentru a determina severitatea diabetului la o persoană prin determinarea modificării încărcăturilor de hemoglobină din cauza modificărilor grupelor amino. De asemenea, permite analiza alimentelor sau a semințelor. Este utilizat în principal pentru următoarele aplicații: separarea proteinelor în funcție de PI, controlul alimentelor, adică dacă există urme de animale, face posibilă diferențierea cazeinelor, proteinelor găsite în produsele lactate, caracterizarea anumitor specii de plante, cum ar fi grâul și în cele din urmă, este utilizat pentru analize clinice de rutină, printre altele pentru α-amilază sau pentru identificarea diferitelor izoenzime ale alcoolului dehidrogenazei.
Focalizarea izoelectrică are mai multe avantaje față de alte metode de electroforeză.
În primul rând, focalizarea izoelectrică permite un număr mai mare de probe care sunt studiate pe același gel fără a reduce rezoluția rezultatelor. Pentru a avea o rezoluție mai bună în alte metode, este important să aveți doar un eșantion mic. Focalizarea isoelectrică nu necesită denaturarea proteinelor, astfel încât pentru analiza ulterioară a rezultatelor, colorarea sau detectarea anticorpilor nu este împiedicată de denaturare.
Dacă se compară focalizarea izoelectrică cu metodele care au aplicații similare, de exemplu reacția în lanț a polimerazei (PCR), este mai eficientă, are o expresie mai bună, este mai economică, mai ușor de realizat și de analizat. Are avantajul de a contracara difuzia moleculei în afara pI-ului său, deoarece atunci când molecula se găsește într-o zonă care nu este pI-ul său, va fi încărcată și, prin urmare, va migra în zona sa de pI datorită câmpului electric. Cu toate acestea, poate fi dificil de reprodus, timpul de analiză este lung și nu este o tehnică ușor de automatizat.