Cromatografia în fază supercritică (SFC sau SPC) este o metodă de cromatografie cu ajutorul unui fluid supercritic ca fază mobilă.
SFC a fost implementat pentru prima dată în 1962.
Spre deosebire de principalele tehnici cromatografice ( GC și LC ), această metodă necesită ca ieșirea coloanei să fie presurizată. Este o condiție necesară pentru a crea această fază mobilă intermediară, de mare energie internă, care transferă substanțe dizolvate ca un gaz și le dizolvă ca un lichid. Acest lucru deschide un câmp vast de condiții de funcționare tridimensională în care presiunea poate fi variată, pe lângă temperatura (dimensiunea GC) și compoziția fazei mobile (dimensiunea LC).
Există o singură fază mobilă care este utilizată în mod obișnuit pentru cromatografia în fază supercritică: dioxid de carbon (punct critic de = 31˚C și = 7,4MPa). Caracteristicile sale ecologice (toxicitate redusă, neinflamabil, necoroziv) au făcut din aceasta principala fază mobilă a cromatografiei supercritice. Cu toate acestea, deoarece dioxidul de carbon este o moleculă plană, simetrică, cu un unghi între legăturile O = C = O de 180˚, molecula nu are un moment dipol. Prin urmare, nu are nicio interacțiune cu moleculele polare. Acesta este motivul pentru care este necesar să adăugați un co-solvent, cum ar fi metanol, etanol sau izopropanol. Acest co-solvent este în general un solvent protic, care se poate lega cu molecule polare. Co-solventul nu depășește niciodată 30% din compoziția fazei mobile. În unele cazuri, apa poate fi utilizată pentru a crește semnificativ polaritatea fazei mobile. Astfel, jucând cu raportul dioxid de carbon / co-solvent, este posibil să se facă faza mobilă mai mult sau mai puțin polară și astfel să se separe mai eficient moleculele polare. Un alt punct care face din dioxidul de carbon un bun eluent în SFC este faptul că temperatura sa critică este foarte scăzută. În acest sens, poate fi utilizat pentru a separa compușii termolabili care în mod normal s-ar degrada dacă temperatura ar fi mai mare.
Un fluid supercritic este definit ca o fază în care densitatea fazei gazoase este egală cu cea a fazei lichide indiferent de presiune și temperatură. În natură, există trei faze predominante sub care o moleculă poate apărea în mod natural. Aceste trei faze sunt faza solidă, faza lichidă și faza gazoasă. Faza unei molecule depinde exclusiv de temperatură și presiune. Cele trei faze sunt în echilibru între ele în funcție de temperatură și presiune.
Figura 1: Diagrama stării materiei în funcție de temperatură și presiune
Acest grafic arată predominanța fiecărei faze în funcție de temperatură și presiune. În colțul din dreapta sus al acestuia, există un punct numit punct critic. Acest punct reprezintă temperatura și presiunea necesare, astfel încât să nu mai existe nicio diferență între faza lichidă și faza gazoasă. De asemenea, deasupra punctului critic, nu mai există o linie care să separe faza lichidă de faza gazoasă. Acest lucru poate fi explicat prin faptul că din punctul critic densitatea și presiunea fazei gazoase și a fazei lichide sunt aceleași. Prin urmare, este o nouă fază, denumită în mod obișnuit fluid supercritic și care are proprietăți intermediare care se află între cele ale unui gaz și ale unui lichid. Fiecare gaz are un punct critic asociat cu o componentă de temperatură și presiune numită respectiv temperatură critică și presiune critică.
Instrumentele comerciale adecvate permit programarea presiunii independent de debit și sunt disponibile la nivel mondial din 1992. SFC funcționează fie cu coloane căptușite, fie împachetate. Acestea au sporit în mod decisiv dinamismul aplicațiilor din 1996. Din acest motiv, instrumentele și metodele SFC sunt prezentate astăzi ca forme avansate de înaltă performanță LC ( HPLC ). Sistemele SFC funcționează atât în scopuri analitice, cât și în scopuri pregătitoare, la un cost rezonabil peste costul unei stații HPLC convenționale.
În ciuda faptului că este un fel de amestec de alte două tipuri de cromatografie, cromatografia în fază supercritică are caracteristici speciale. Într-adevăr, specialitatea cromatografiei în fază supercritică este separarea enantiomerilor. Versatilitatea în proprietăți îi permite să efectueze separarea mai rapid decât cromatografia lichidă de înaltă performanță din două motive: în primul rând, deoarece coeficientul de transfer de masă al unui fluid supercritic este mai mic decât cel al unui gaz, rata de retenție a acestuia va fi mai mare. Pe de altă parte, după fiecare cromatografie, există un timp de echilibrare a fazelor. Acest timp este mult mai scurt în cromatografia în fază supercritică decât în cromatografia lichidă de înaltă performanță. De asemenea, proprietățile gazoase ale fluidelor supercritice fac posibilă efectuarea cromatografiilor similare cu cele ale cromatografiilor în fază gazoasă, dar la o temperatură mai scăzută. Aceasta are consecința evitării, în timpul analizelor cromatografice, a racemizării anumitor molecule, cum ar fi enantiomerii. Apoi, utilizarea exclusivă a dioxidului de carbon ca fază mobilă reduce considerabil numărul de deșeuri toxice, comparativ cu alte tipuri de cromatografie. Dioxidul de carbon este, de asemenea, ușor de îndepărtat dacă cromatografia supercritică este combinată cu o altă tehnică analitică. Pentru a face această tehnică mai ecologică și mai ecologică, este, de asemenea, posibilă recuperarea dioxidului de carbon pentru a-l reutiliza în timpul separării viitoare.
SFC satisface cel mai bine nevoile industriale prin metodele sale rapide, extrem de eficiente și rentabile, care contribuie la eforturile de raționalizare în domeniul separărilor moleculare.
Fluidele supercritice sunt utilizate ca fază mobilă în timpul cromatografiei în fază supercritică. Acestea oferă mai multe avantaje față de lichide și gaze. În primul rând, vâscozitatea fluidelor supercritice este în medie de 10 până la 20 de ori mai mică decât lichidele. O vâscozitate mai mică înseamnă că rezistența inversă creată de coloană este mai mică, promovând astfel faptul că un volum mai mare de fază mobilă poate fi injectat în coloană. Fluidele supercritice au, de asemenea, un coeficient de transfer de masă mai mic decât cel al lichidelor. În plus, coeficientul de difuzie al fluidelor supercritice este mult mai mare decât cel al fazei gazoase sau lichide a substanței corespunzătoare. Prin urmare, acest lucru asigură faptul că același volum de fază mobilă poate transporta mai multe probe pentru a fi separate. Un alt punct interesant al fazei supercritice este faptul că interacțiunile intermoleculare dintre particulele fazei mobile sunt foarte slabe. Viteza de difuzie în orice solid devine, prin urmare, extrem de rapidă. Fluidele supercritice au, de asemenea, proprietăți similare compușilor cu polaritate scăzută. În funcție de temperatura ajustată la fluidul supercritic, este posibil să se joace cu aceste proprietăți, fie pentru a face să arate mai mult ca un lichid, fie mai mult ca un gaz. Prin urmare, este posibil ca cromatografia în fază supercritică să arate ca cromatografia lichidă de înaltă performanță sau cromatografia gazoasă. Astfel, optimizarea cromatografiei este ușoară, deoarece prin schimbarea presiunii sau temperaturii, este posibil să se modifice semnificativ proprietățile fizice și chimice ale fazei mobile. Prin urmare, acest tip de cromatografie poate fi eficient, deoarece folosește mai multe proprietăți ale altor tipuri de cromatografie.
Folosind o ecuație derivată din parametrul de solubilitate Hildebrand, este posibil să se calculeze solubilitatea unui compus într-o fază supercritică.
Unde este solubilitatea, este presiunea critică a solventului, este densitatea solventului ca gaz și densitatea solventului ca lichid.
Astfel, cu ecuația ( 1 ) este posibil să vedem că presiunea fazei mobile influențează solubilitatea analitului. Prin urmare, presiunea ridicată va crește cantitatea de analit extrasă de faza mobilă și, în același timp, va crește eficiența extracției. Astfel, deoarece presiunea este extrem de mare, acest lucru face ca faza mobilă să fie în formă supercritică, promovând astfel creșterea în extracție în mod semnificativ.
Ca și în cromatografia lichidă de înaltă performanță, injectarea fazei mobile are loc chiar la începutul procesului. Se poate face folosind două metode diferite, în funcție de tipul de cromatografie utilizat. Prima metodă este o pompă seringă standard care furnizează fluid supercritic în mod continuu la ansamblu. Această metodă este utilizată atunci când temperatura critică și presiunea rămân constante pe tot parcursul cromatografiei. A doua metodă este o pompă cu piston care poate controla fluxul fluidului. După cum sa menționat mai sus, o a doua componentă poate fi adăugată amestecului pentru a schimba proprietățile fazei mobile. Pentru acest al doilea fluid, o a doua pompă este conectată la o cameră de amestecare care permite amestecarea celor doi constituenți ai fazei mobile. Pe lângă asigurarea unui flux bun al fazei mobile în coloană, pompele permit aducerea fluidelor la o presiune suficient de mare, astfel încât să depășească presiunea critică a dioxidului de carbon. În cele din urmă, o cameră de control termostatic este instalată între camera de amestecare și coloană pentru a aduce amestecul la o temperatură peste temperatura critică a CO 2 .
Soluția de analizat este injectată direct în faza mobilă din amonte de coloană. Analitul, încălzit anterior și presurizat la același parametru ca faza mobilă, se amestecă singur cu acesta din urmă pentru a fi separat.
Pentru a realiza separarea, în general se utilizează o coloană capilară sau o coloană de tip ultra-bor. Tehnica este similară cu cea a cromatografiei lichide de înaltă presiune: în funcție de polaritatea compușilor, analiții vor interacționa într-un mod diferit cu faza staționară care se află pe coloană. Timpul lor de reținere, care este timpul necesar unui compus pentru a trece prin coloană și pentru a ajunge la detector, este specific fiecărei molecule în ceea ce privește faza mobilă și faza staționară. Compușii care interacționează mai puțin cu faza staționară vor trece mai repede prin coloană și vor ajunge mai repede la detector. În schimb, compușii care au mai multe afinități chimice cu faza staționară vor fi reținuți mai mult în coloană și vor ajunge la detector la final. Astfel, detectorul va trimite un semnal de fiecare dată când un analit ajunge la el. Ulterior, cromatografia de fază supercritică poate fi cuplată cu un alt tip de detecție, cum ar fi spectrometrul de masă. Acest lucru mărește precizia analizei analiților. Cuplarea cu o altă metodă de spectroscopie, cum ar fi MS, face posibilă obținerea de informații cu privire la natura moleculelor separate. Dacă SFC nu este cuplat cu un dispozitiv de tip MS, detectorul va oferi informații mai degrabă calitative decât cantitative. Se pot utiliza detectoare precum FID sau altele bazate pe principiile difracției luminii, fluorescenței sau absorbției în UV.
Cromatografia supercritică nu poate fi utilizată doar ca analizor, ci și ca metodă de separare pentru a obține un compus pur. Astfel, când extracția este completă, analitul separat se găsește amestecat cu fluidul supercritic. Pentru a recupera proba pură, se utilizează o metodă convențională. Această metodă constă în reducerea semnificativă a presiunii fazei mobile pentru a trece solventul din faza supercritică în faza gazoasă și astfel face analitul aproape insolubil în faza mobilă. Pentru recuperarea probei, un alt solvent a cărui constantă de solubilitate este mult mai mare este amestecat cu faza mobilă acum în faza gazoasă. O altă metodă mai puțin costisitoare care poate fi utilizată constă și în scăderea temperaturii, mai degrabă decât a presiunii. Această metodă utilizează același principiu: faza mobilă nu va mai fi supercritică și analitul va trece de la faza mobilă la compusul ales pentru extragerea analitului. . În cele din urmă, proba izolată poate fi acum solidificată utilizând o tehnică convențională de recristalizare. Acest lucru face posibilă obținerea unui solid pur. Această metodă poate fi, de asemenea, utilizată pentru a purifica faza mobilă pentru a o recicla și a o reutiliza pentru extracții ulterioare.
Proprietățile fluidelor supercritice pot face posibilă optimizarea anumitor separări cromatografice în cromatografia de fază supercritică. Într-adevăr, este posibil ca în timpul cromatografiei să se facă o modificare a presiunii sau temperaturii pentru a modifica proprietățile chimice și fizice ale fazei mobile. O schimbare de acest tip ar putea crește precizia cromatografiei. De exemplu, dacă doi compuși au timpi de retenție foarte similari, creșterea presiunii în coloana cromatografică ar putea reduce timpul de retenție a unuia dintre compuși, ceea ce ar asigura o separare mai bună pe cromatogramă. Un alt exemplu ar fi să începeți cu orice presiune, apoi odată ce primul analit a ieșit din coloană, creșteți semnificativ presiunea pentru a reduce timpul de reținere al celui de-al doilea analit. Aceeași tehnică poate fi utilizată și cu temperatura.
Industria farmaceutică este utilizatorul principal, în special pentru separarea enantiomerilor de moleculele chirale .