ATPmétrie (sau ATPmétrie) este o tehnica de biologie moleculara bazate pe principiul bioluminiscență , care poate măsura aproape instantaneu cantitatea de ATP (adenozin trifosfat) , prezentă într - o probă.
ATP este sursa primară de energie pentru toate celulele vii. Fiecare celulă vie o produce și o consumă. Prin urmare, orice urmă de ATP este martorul unei urme de viață. Astfel, cuantificarea ATP-ului prezent în celule face posibilă cuantificarea microorganismelor totale (flora totală sau biomasa totală). Măsurarea se face folosind un luminometru care dă rezultatul în câteva secunde în Unități de lumină relativă (URL sau RLU în engleză).
ATP-metria are multe aplicații în domenii foarte variate, cum ar fi controlul microbiologic al apei, diverse băuturi, suprafețe din industria alimentară ( HACCP ) sau în piscine și chiar aer.
ATP-metria este o tehnică de măsurare bazată pe principiul bioluminiscenței. Reacția de bioluminiscență este catalizată de o enzimă produsă de licurici: luciferaza . Această reacție are loc datorită activării luciferinei , în prezența oxigenului și magneziului, prin hidroliza adenozin trifosfatului (ATP). Dacă concentrațiile de luciferină-luciferază și oxigen sunt menținute constante, atunci intensitatea luminii este proporțională cu cantitatea de ATP. Prin utilizarea luciferinei și luciferazei cu licurici, este posibil, datorită unui luminometru, să se evalueze contaminarea unei probe.
ATPmetria este o măsură a florei totale, adică nu permite identificarea specifică a bacteriilor sau a altor specii. Este utilizat ca indicator pentru a estima riscul contaminării apei de către microorganisme patogene , precum și pentru monitorizarea riscului legionelelor . Permite monitorizarea unei instalații, dar și stabilirea cartografiei unei rețele de apă sau aer pentru a identifica punctele critice.
ATPmetria calitativă există din anii 1980. Această tehnică este, în general, sub forma unui „stilou” care încorporează un tampon de bumbac sau aripioare pentru prelevare, și reactivul de măsurare în partea superioară.
Măsurarea bioluminiscenței durează doar câteva secunde și se face folosind un luminometru care dă rezultatul în RLU. Cu toate acestea, în funcție de eșantion, de vârsta enzimei, de luminometrul utilizat sau de condițiile de analiză (pH, temperatură, inhibitori sau activatori), RLU-urile pentru aceeași cantitate de ATP pot varia foarte semnificativ. Acest lucru face comparațiile dificile de la un eșantion la altul și imposibil de la un tip de luminometru la altul. Această abordare este însă utilizată pe scară largă pentru analize „curate vs murdare”.
Metria calitativă a ATP este utilizată în principal pentru controlul suprafețelor din industria alimentară în abordările de tip HACCP . Proba este prelevată prin frecarea unui tampon pe suprafața de testat. Tamponul este apoi contactat cu reactivii pentru a începe reacția de bioluminescență.
Această metodă oferă o stare de curățenie a suprafeței, dar nu permite să se cunoască cantitatea de microorganisme prezente. Se obține doar un răspuns „pozitiv / negativ”.
Lipsa standardizării metodei face dificilă utilizarea într-un mediu industrial cu rezultate dificil de interpretat.
Metria ATP calitativă este, de asemenea, utilizată pentru a controla apa încărcată puternic cu bacterii. Proba este prelevată prin înmuierea tamponului în apa de analizat. Doar aproximativ 100 µl de probă sunt analizate, ceea ce face fiabilitatea măsurătorii foarte scăzută. Într-adevăr, proba luată nu este reprezentativă pentru apa analizată, iar pragurile de sensibilitate sunt foarte mari. Pentru a remedia această problemă, este posibil să se efectueze mai multe analize ale aceleiași ape (3 până la 5) pentru a lua o medie a rezultatelor.
În același mod ca și pentru suprafețe, se obține doar un răspuns „pozitiv / negativ” deoarece nu există o calibrare a măsurătorii.
Această evoluție a ATPmetry integrează calibrarea măsurării prin utilizarea unui standard pentru a comuta de la RLU-uri la picograma ATP. S-a stabilit că atunci când se ia în considerare biomasa totală, fiecare bacterie conține în medie 1 femtogramă de ATP (Wilfred, 1991). Astfel, este posibil să se estimeze cantitatea de bacterii prezente într-o probă luând ca convenție: 1 pg de ATP ≈ 1000 echivalenți de bacterii.
2 nd generație ATPmetry include , de asemenea , cel mai adesea o etapă de filtrare .
Aceasta este adăugarea unei cantități cunoscute de ATP. Această adăugare poate fi externă sau internă.
Într-adevăr, reacția de bioluminescență fiind guvernată de o enzimă , este sensibilă la mediu: temperatura exterioară, temperatura și pH-ul probei, prezența inhibitorilor sau activatorilor, starea enzimei etc. dar și la tipul de luminometru utilizat. Prin urmare, doar interpretarea RLU-urilor nu este relevantă. Utilizarea unui martor intern (adaos contorizat) sau extern permite calibrarea măsurătorii. Adăugarea internă dozată are avantajul de a lua în considerare toate constrângerile de mediu care acționează asupra enzimei pentru fiecare probă (temperatură, pH, conținut de sare, inhibitori etc.).
Standardizarea face posibilă obținerea unui rezultat cantitativ și exploatabil fără ca manipularea să fie nici mai lungă, nici mai costisitoare.
În funcție de abordare, etapa de filtrare poate concentra câțiva mililitri de probă la mai mult de un litru. Utilizarea unei etape de filtrare are multe avantaje:
După etapa de filtrare, se utilizează o soluție de liză pentru a liza bacteriile și a elibera ATP intracelular în mediul de reacție.
Datorită filtrării și standardizării, ATPmetria cantitativă a devenit o metodă foarte robustă, mai ales dacă folosește tehnica de adăugare internă măsurată. Constrângerile de mediu nu afectează rezultatul. Este posibilă o estimare a florei totale conținute în eșantion.
Această metodă de analiză este foarte sensibilă și face posibilă atingerea pragurilor limită de detecție de până la 0,1 pgATP pe litru, adică 100 echivalente de bacterii în 1 litru.
Avantajul major al acestei tehnici este că este ușor de utilizat în teren și oferă rezultate în timp real. Scanarea completă se poate face în mai puțin de 2 minute.
ATPmetry este utilizată în multe domenii de activitate.
In apaATPmetry este un indicator excelent al nivelului de dezvoltare a biomasei și, prin urmare, al nivelului de risc. Într-adevăr, colonizarea suprafețelor (peretele conductelor de apă, sistemele de aer condiționat) de către biomasă sau biofilme este un factor important în riscul dezvoltării Legionella .și alte bacterii precum Pseudomonas aeruginosa și Staphylococcus aureus .
Prin urmare, monitorizarea biomasei active face posibilă estimarea și controlul riscului. Costurile de încărcare ale unei instalații și impactul acesteia asupra mediului sunt astfel reduse prin optimizarea utilizării biocidelor .
Viteza acestei metode permite monitorizarea zilnică pentru a reacționa rapid la orice variație a biomasei dintr-o instalație, spre deosebire de metodele convenționale, cum ar fi cultura celulară sau PCR cantitativă .
ATPmetria cantitativă este, de asemenea, un instrument de diagnosticare a rețelei foarte bun, deoarece permite localizarea rapidă a unui element defect, prezența brațelor moarte sau problemele de omogenizare ale unui biocid într-o zonă de stocare.
Apă industrialăUtilizarea ATPmetry este larg răspândită în turnurile de răcire a aerului, unde riscul legionelei este foarte prezent. Apoi este utilizat în mod obișnuit în biomonitorizare pentru a anticipa derivații și pentru a evita depășirile de reglementare.
Apa fierbinteApa sanitară caldă este, de asemenea, sensibilă la dezvoltarea legionelei în conducte. ATPmetry este utilizată pentru a preveni acest risc.
Apă potabilăDatorită limitelor de detectare și cuantificare din ce în ce mai scăzute, ATPmetry este acum utilizată pentru controlul apei destinate consumului uman . Poate fi utilizat atât pentru analiza procesului de tratare, cât și pentru controlul rețelei de distribuție a apei potabile . Acest instrument de analiză extrem de rapid și bazat pe câmp face posibilă anticiparea derivațiilor și depășirilor de reglementare. Pragurile acceptate în mod obișnuit sunt 0,1 pg de ATP per mililitru la ieșirea lanțului de producție și 0,5 pg de ATP în rețeaua de distribuție.
Apa uzinei de epurare a apelor uzateATPmetry este utilizată acolo pentru a cunoaște starea de sănătate a biomasei active pentru a optimiza condițiile de funcționare a stației de epurare .
Apă de balastATPmetry este utilizată pentru a preveni riscul pentru sănătate.
Apă ultra-purăATPmetry este utilizată pentru controlul apei ultra-pure în domeniul microelectronicii sau al dializei, de exemplu.
Baie de clătireATPmetry este, de asemenea, utilizat pentru a monitoriza creșterea bacteriilor în băile de clătire de galvanizare de lux.
Pe suprafețeVerificarea curățeniei suprafețelor implică adesea o inspecție vizuală simplă. Cu toate acestea, acest lucru nu este suficient pentru a evalua corect starea microbiologică a suprafeței. ATPmetry este o metodă care permite o idee mai precisă.
Este utilizat pe scară largă în industria alimentară, în principal sub formă calitativă. Cu toate acestea, confruntat cu lipsa de fiabilitate a acestei metode, tot mai mulți producători apelează la ATPmetry cantitativă, care are avantajul de a putea caracteriza nivelul de murdărie. Permite controlul suprafețelor pentru a valida procedurile de curățare și dezinfecție puse în aplicare.
Există, de asemenea, un interes din ce în ce mai mare în domeniul piscinelor în care ATPmetry este utilizată pentru cartografierea unității și astfel identificarea zonelor favorabile dezvoltării microbiene. Procedurile de curățare sunt apoi adaptate la rezultatele obținute.
In aerControlul calității aerului este deosebit de minuțios în spitale unde agenții biologici sunt adesea vectori ai bolilor infecțioase . Este, de asemenea, utilizat pentru controlul camerelor curate care privesc industria alimentară sau industria farmaceutică, cercetarea biologică, precum și sălile de operații.
Controalele microbiologice sunt din ce în ce mai solicitate. ATPmetry a fost utilizată pentru a cuantifica biomasa totală direct pe teren în timpul unui proiect de cercetare.
ATPmetry este acum posibilă pe probele de aer.
În combustibiliDin 2006, ATPmetry a fost utilizată în combustibilii aerieni pentru a detecta prezența microorganismelor care pot pune în pericol siguranța zborului sau pot degrada echipamentele. Este o metodă de referință pentru analiza microbiologică a combustibililor.
În sânge și fluide corporaleÎn timp ce ATPmetry este operațională pentru a măsura ATP în apă, aer și pe suprafețe, a fost testată pentru aplicarea pe sânge , în special, și pe alte fluide, cum ar fi urina , pentru a detecta timpuriu riscul de infecții bacteriene. Cu toate acestea, metoda se opune multor inhibitori prezenți în fluidele biologice și, prin urmare, este dificil de aplicat.
ATPmetry este o măsură a florei vii totale. Studiile au comparat această metodă cu tehnici mai tradiționale, cum ar fi cultura pe mediu R2A, qPCR și citometria în flux. Studiile au arătat o bună corelație a ATPmetry cu diferitele metode de analiză.
Concentrația de ATP într-o celulă variază în funcție de starea sa fiziologică, în timp ce pentru o celulă „adultă” vie, nivelul nucleotidelor adenilice (NA) este constant. Acest lucru se explică prin starea fiziologică a biomasei dominante a mediului. Orice celulă vie, într-o stare de viață încetinită (spori de exemplu), nu are practic ATP, dar o mulțime de AMP. Prin urmare, este util să se analizeze concentrațiile intra și extra celulare de NA (ATP + ADP + AMP). Și asta fără a extinde timpul de răspuns în comparație cu doza de ATP singură. Astfel, nu numai că mărim pragul de detecție (în aproape toate cazurile studiate până în prezent, am câștigat un factor de 3 jurnale și chiar am ajuns la un factor de 5 jurnale).
Cu toate acestea, datorită amestecului de enzime necesar pentru această abordare, această analiză este greu de standardizat și, prin urmare, prezintă probleme similare cu ATPmetria calitativă.