Transferul de energie între moleculele fluorescente

Transferul de energie între molecule fluorescente sau transfer de energie prin tip Förster rezonanță (în limba engleză, prin transfer Förster de energie de rezonanță sau FRET , transferul energiei de rezonanță sau RET sau de transfer de energie electronică sau EET ), deși observate de Perrin la început XX - lea secol, descris pentru prima dată de către Theodor Förster în 1946. aplicarea acestei abordări pentru studierea interacțiunilor de proteine apar spre sfârșitul XX - lea secol.

Condițiile transferului de energie

Potrivit lui Theodor Förster teoria , FRET este definit ca un transfer de energie non-radiativă (fără emisie de lumină) care rezultă dintr - un dipol - dipol interacțiune între două molecule (donor de energie și acceptor). Acest fenomen fizic necesită compatibilitate energetică între aceste molecule. Aceasta înseamnă că spectrul de emisie al donatorului trebuie să se suprapună, cel puțin parțial, pe spectrul de absorbție al acceptorului (Figura 1.A). Această suprapunere a spectrelor este definită de o integrală numită integrală de suprapunere J (λ):

{\ displaystyle J = \ int f _ {\ rm {D}} (\ lambda) \, \ epsilon _ {\ rm {A}} (\ lambda) \, \ lambda ^ {4} \, d \ lambda}

unde este intensitatea fluorescenței emise de către donator la o anumită lungime de undă și coeficientul de extincție molară a acceptor. Factorul J reflectă, prin urmare, capacitatea unei perechi de fluorofori de a emite și absorbi energie la aceeași lungime de undă. ${\ displaystyle f _ {\ rm {D}}}$ ${\ displaystyle \ epsilon _ {\ rm {A}}}$

În conformitate cu teoria lui Förster, FRET este un proces care depinde de distanța dintre cele două molecule, donator și acceptor, așa cum se arată prin următoarea formulă:

{\ displaystyle E = {\ frac {1} {1+ (R / R_ {0}) ^ {6}}} \!}

unde R este distanța efectivă dintre cele două molecule și raza Förster. Aceasta din urmă corespunde distanței donator-acceptor pentru care eficiența transferului de energie este de 50% (Figura 1.B). Aceasta înseamnă că atunci când distanța donator-acceptor este egală cu raza Förster, probabilitatea ca donatorul să se dezactiveze prin transferul de energie non-radiativă pe acceptor este de 50%. Această probabilitate de de-excitație crește în favoarea transferului de energie pe măsură ce distanța dintre fluorofori donator și acceptor scade. Celelalte căi de de-excitație corespund căilor radiative (fluorescență) și non-radiative (stingerea oxigenului, stingerea etc.). Raza Förster depinde de natura fluoroforilor utilizați și este în general între 1 și 10 nm. Dincolo de această gamă, eficiența transferului de energie scade foarte repede. Expresia matematică pentru calcularea acestei distanțe este scrisă: $R_0$

{\ displaystyle {R_ {0}} = (10 ^ {- 3} \; \ kappa ^ {2} \, n ^ {- 4} \, Q_ {D} \, J) ^ {1/6} \ ori 9730}

unde J este integrala de recuperare, n indicele de refracție al mediului ( este în general între 1/3 și 1/5), eficiența cuantică a donatorului în absența acceptoare și factorul de orientare care este o funcție de orientarea relativă a dipolilor donator și acceptor (Figura 1.C). Chiar dacă valoarea lui este teoretic între 0 și 4, 2/3 este valoarea utilizată de obicei pentru a determina R 0 . De fapt, este asimilat la 2/3 atunci când donatorul și acceptorul au un grad suficient de libertate pentru a fi orientați aleator în spațiu. Această condiție este îndeplinită în general pentru fluorofori atașați la biomolecule, deoarece acestea pot avea o anumită libertate de rotație. ${\ displaystyle n ^ {- 4}}$ ${\ displaystyle Q_ {D}}$ ${\ displaystyle \ kappa ^ {2}}$ ${\ displaystyle \ kappa ^ {2}}$ ${\ displaystyle \ kappa ^ {2}}$

O moleculă capabilă să emită un semnal de fluorescență se numește fluorofor . Diferite caracteristici fotofizice fac posibilă definirea acestuia:

spectrele de excitație și emisie. Ele reprezintă semnătura structurii energetice a fluoroforului. Diferența de lungime de undă între maximul lor se numește schimbarea Stokes ;
coeficientul de extincție molar (ε). Corespunde capacității de absorbție de către fluorofor a energiei furnizate de un foton la o lungime de undă dată;
eficiența cuantică (Φ). Caracterizează capacitatea fluoroforului de a emite din nou sub formă de lumină, energia absorbită. Este definit ca fiind raportul dintre numărul de fotoni emiși și numărul de fotoni absorbiți;
durata de viață a fluorescenței (τ). Reprezintă timpul mediu de ședere al fluoroforului în starea sa excitată.

Cum să evidențiați FRET?

FRET măsoară intensitățile. Experimental, acest semnal poate fi măsurat folosind un fluorometru sau la microscopie . Într-un fluorimetru, semnalul FRET măsurat provine dintr-o populație de celule plasate în puțuri de dimensiuni diferite, în funcție de microplăcile utilizate. În contrast, tehnicile microscopice măsoară evenimentele de transfer de energie la scara subcelulară. Indiferent de tipul de detecție ales, măsurarea unui FRET între doi fluorofori poate fi efectuată în moduri diferite.

Primul constă în cuantificarea variațiilor de intensitate a fluorescenței prin măsurarea scăderii fluorescenței donatorului, creșterea în cea a acceptorului sau prin calcularea unui raport pe care îl vom numi raport (fluorescență de emisie a fluorescenței de emisie acceptor / donator). Această analiză poate fi efectuată atât în microplacă, cât și în microscopie. Principala dificultate în analiza acestor semnale vine de la suprapunerea care poate exista între spectrele de excitație și emisie ale fluoroforilor utilizați. Această lipsă de selectivitate spectrală este la originea unui zgomot de fond semnificativ, ca urmare a unei reduceri a sensibilității testului. Perechile de fluorofori precum fluoresceina / rodamina sau proteinele CFP (proteina fluorescenta cian) / YFP (proteina fluorescenta galbena) prezinta acest tip de limitare. Cu toate acestea, semnal-zgomot al FRET-ului poate fi îmbunătățit prin eliminarea unora dintre semnalele parazite în virtutea unei citiri rezolvate în timp. Acest lucru este posibil în TR-FRET (Transfer de energie de rezonanță Förster rezolvat în timp) datorită utilizării fluoroforilor de lungă durată, cum ar fi chelații de pământuri rare sau criptatele (europiu, terbiu). Până în prezent, TR-FRET se aplică numai în formate de microplacă.

Alte metode de a face posibilă determinarea în mod indirect existența unei FRET de fotooxidare (pbFRET). Fotoblanșarea este o metodă de stingere a fluoroforului prin expunere prelungită la o sursă de lumină. Implementarea acestei abordări este preferabilă în microscopia confocală, deoarece este astfel posibil să se obțină o rezoluție spațială bună pentru a stinge direct fluoroforii din mediul lor celular.

În cazul FRET de fotooxidare (pbFRET), al fotooxidare fluoroforului donor determină o scădere a intensității fluorescenței care se măsoară în prezența sau absența unui acceptor. Când acceptorul se află în imediata apropiere a donatorului, apare FRET și intră în competiție cu procesul de albire foto. Această competiție are ca rezultat o creștere a rezistenței donatorului la albire foto, ale cărei constante de timp măsurate (în prezența sau absența unui acceptor) fac posibilă demonstrarea unui transfer de energie.

O altă metodă în comparație cu donatorul pbFRET este acceptorul pbFRET numit și DFRAP pentru recuperarea fluorescenței donatorului după fotoblanșarea acceptorului. Emisiile de fluorescență ale donatorului și ale acceptorului sunt măsurate înainte și după albirea fotolitică a acceptorului. Creșterea fluorescenței donatorului după distrugerea acceptorului este un argument pentru a demonstra existența unui FRET între cele două molecule. Exemplul din figura 2 ilustrează acest principiu. În acest experiment, o proteină de fuziune formată din două proteine de auto-etichetare, SNAP-tag și CLIP-tag (etichetă de proteină de auto-etichetare), este exprimată pe suprafața celulelor HEK293T printr-o ancorare de către un helix transmembranar alfa (Figura 2A) .

Aceste proteine de 20 kDa, ambele derivate din O 6 -alchilguanină-ADN alchiltransferază (AGT) umană , sunt specificate în mod specific cu compuși O 6- benzilguanină (BG) și respectiv compuși O 2- benzilcitozină (BC) care au fluorofor. Proteina SNAP-tag este marcată cu un derivat BG-AlexaFluor 488 (Alexa488) și proteina CLIP-tag cu un derivat BC-Cyanine 5 (Cy5) (FIG. 2A). Apropierea puternică dintre fluorofori din cadrul proteinei de fuziune, precum și suprapunerea spectrului de emisie al donatorului (Alexa488) cu spectrul de absorbție al acceptorului (Cy5) (Figura 2B, suprafața hașurată) sunt două condiții favorabile stabilirii. a transferului de energie intramoleculară (Figura 2A). Acest transfer de energie poate fi demonstrat de creșterea semnalului Alexa488 (500 - 600 nm) după albirea fotocalică a Cy5 (Figura 2C, 2D). În acest experiment, acceptorul a fost complet fotoblanjat, adică până la semnalul său (650-700 nm) după albirea fotoficială la nivelul semnalului provenit de la celulele vecine netransfecționate (zgomot de fond). Eficiența transferului de energie E A în acest experiment de fotobleaching acceptor poate fi calculată din următoarea formulă:

E A = F D post - F D pre / F D post = E × α × β

Postul F D reprezintă semnalul donatorului după fotoblanșarea acceptorului și F D pre reprezintă semnalul donatorului înainte de fotoblanșarea acceptorului. α este fracția de donator care interacționează cu acceptorul și β fracția de acceptori fotoblanchiți în raport cu fluorescența inițială a acceptorului înainte de albirea fotoblanșă (100% în acest experiment). Deoarece aceasta este o proteină de fuziune cu cele două proteine SNAP-tag și CLIP-tag în tandem care transportă fluoroforul donator și respectiv acceptor (randamentul de etichetare al SNAP-tag și CLIP-tag = 100%), valoarea lui α este egală cu 1 De fapt, valoarea eficienței FRET măsurate este egală cu eficiența reală FRET. În acest experiment, eficiența FRET a fost calculată din media măsurătorilor efectuate pe 30 de celule diferite. Valoarea obținută pentru E este de 39 ± 6% (± deviație standard). Ignorând posibilele schimbări în orientarea relativă a momentelor dipolare de emisie a donorului și absorbția acceptorului, se poate determina distanța aparentă dintre cei doi fluorofori, d = 60 Å (ångström).

Mai general, DFRAP utilizează perechea de proteine fluorescente CFP / YFP. Cu toate acestea, lucrările publicate în 2005 au făcut posibilă demonstrarea faptului că fotoblanșarea YFP este însoțită de apariția unui semnal de fluorescență în canalul CFP și că, în absența CFP. Această lucrare arată, de asemenea, că citrinul și Venus pot genera, după fotoblanșare, specii care prezintă o emisie similară cu cea a CFP. Mecanismul pentru conversia eYFP, Citrin și Venus în CFP-like nu este încă cunoscut.

Utilizarea duratei de fluorescență a donatorului este, de asemenea, o abordare adecvată pentru măsurarea evenimentelor FRET. Această metodă constă în măsurarea declinului fluorescenței donatorului în timp. Acest lucru se poate face atât pe populații de celule în format microplacă, cât și prin tehnici microscopice. Baza fizică a acestei abordări se bazează pe faptul că durata de viață a unei molecule fluorescente depinde în special de eficiența procesului FRET. Prin urmare, cu cât transferul de energie între cele două molecule este mai eficient, cu atât declinul fluorescenței donatorului este mai rapid. FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) este un exemplu de tehnologie bazată pe analiza vieții. Este de preferat cu acest tip de abordare să se utilizeze molecule fluorescente a căror scădere a fluorescenței este monoexponențială. CPS , de exemplu , este utilizat Flim în ciuda unor dezavantaje datorită eficienței sale reduse cuantic, coeficient redus de extincție molară și în special descompunerea sa fluorescență care are două exponențială. Astfel, pentru a facilita analiza duratei de viață în FLIM, mutațiile acestei proteine au făcut posibilă generarea unei variante numite Cerulean, care este mai strălucitoare decât CFP și care prezintă degradare monoexponențială.

Utilizarea GFP și a derivaților săi în FRET

Poate cea mai importantă inovație în domeniul fluoroforilor a fost descoperirea unei proteine fluorescente care poate fi codificată direct în interiorul celulei. Aceasta este GFP (Proteina Fluorescentă Verde). Exploatarea GFP și generarea de variante ale acestei proteine au permis dezvoltarea tehnologiilor FRET perfect adaptate studiului dinamicii interacțiunilor moleculare în spațiu și timp în interiorul celulelor vii.

Identificată inițial în meduza Aequorea victoria , gena care codifică GFP a fost clonată în 1992 de Prasher și colab. Cristalizată pentru prima dată în 1974, abia în 1996 se obține structura tridimensională a GFP prin difracție cu raze X. Această proteină de 27 kDa are forma unui cilindru de 30 Å ( Ångström ) în diametru și 40 Å de înălțime compusă din unsprezece foi β (9 până la 13 reziduuri pe foaie) care înconjoară o helică α care conține cromoforul (Figura 3.A). Cromoforul rezultă dintr-o reacție de ciclizare spontană a lanțurilor laterale a trei aminoacizi (Serine65 - Tyrosine66 - Glicine67) din interiorul butoiului. Organizarea foilor β, formând o adevărată cușcă, oferă cromoforului propriul mediu.

Fotoactivarea acestei proteine, al cărei maxim de absorbție este la 395 nm, are ca rezultat o reacție autocatalitică care determină emisia de lumină verde cu un vârf de emisie la 508 nm. Au fost produse diferite proteine GFP mutante. Prin schimbarea, printre altele, a structurii celor trei aminoacizi care formează cromoforul, a fost posibilă modificarea lungimilor de undă de absorbție și emisie ale GFP devenind astfel un BFP (Blue Fluorescent Protein), un YFP (Yellow Fluorescent Protein) sau multe alte variante bine caracterizate (CFP, RFP ...) (Figura 3.B). Utilizarea acestor diferiți mutanți ca sonde moleculare le face instrumentele de alegere atât în studiul expresiei genelor, monitorizarea proteinelor și compartimentarea celulară a acestora, cât și în analiza interacțiunilor proteină-proteină prin abordări de transfer de energie. În ceea ce privește acest ultim punct, două perechi de fluorofori au fost utilizate pe scară largă. Aceste molecule BFP / GFP și CFP / YFP derivate din GFP prezintă de fapt proprietăți fotofizice compatibile cu stabilirea unui transfer de energie.

Punctul forte al acestei tehnologii constă în codificarea proteinelor fluorescente. Prin urmare, este posibilă urmărirea localizării celulare a proteinelor la microscopie cu o rezoluție spațială bună. În plus, datorită intensității mari de fluorescență a moleculelor utilizate, fenomenele de transfer de energie pot fi vizualizate direct în celulă, făcând posibilă definirea atât a naturii proteinelor care interacționează, a dinamicii acestor fenomene, cât și a localizării lor celulare.

În domeniul receptorilor cuplați cu proteina G (GPCR) această abordare a fost utilizată pe scară largă pentru a caracteriza dimerizarea receptorilor (asocierea în perechi a proteinelor care formează un receptor funcțional). Fuziunea GFP-urilor la nivelul regiunii carboxi-terminale a receptorilor a făcut posibilă analiza organizării acestora fără a le modifica structura, funcția sau locația în lucrările publicate. Principalul dezavantaj al acestei abordări pentru studiul dimerizării vine din necesitatea de a trece prin microscopie confocală. De fapt, în microscopia convențională cu epifluorescență sau într-un fluorimetru, nu este posibil să se separe semnalul provenit de la receptorii de suprafață de cel al receptorilor reținuți în compartimentele intracelulare. În plus, dificultatea miniaturizării acestei abordări cu microplacă nu permite extinderea acestui tip de analiză la un debit mediu sau mare.

Folosind BRET

MARFĂ în timp rezolvată

General

Principala limitare a FRET este legată de lipsa de selectivitate spectrală a fluoroforilor utilizați, precum și de dificultatea de a scăpa de semnalele parazite (zgomot de fond). Acest lucru are consecințe asupra sensibilității testelor implementate. Astfel, utilizarea trasoarelor care prezintă proprietăți de luminiscență originale a făcut posibilă dezvoltarea unor teste mai sensibile prin îmbunătățirea rezoluției spectrale și temporale a semnalului FRET. Aceste molecule sunt complexe formate prin asocierea unui cromofor ( criptand sau chelat) și a unui cation lantanid aparținând grupului de pământuri rare ( europiu , terbiu etc.). Principala caracteristică a lantanidelor provine din durata lor de viață relativ lungă a luminiscenței (de ordinul unei milisecunde). Durata de viață a fluorescenței majorității fluoroforilor organici și a proteinelor fluorescente este de ordinul unei nanosecunde, la fel ca și fluorescențele parazite (autofluorescență, difracție a luminii etc.). Datorită acestei proprietăți a ionilor de lantanidă, au fost dezvoltate sisteme de detectare a fluorescenței cu fază omogenă și rezolvate în timp. Aceste sisteme se bazează pe aplicarea unei întârzieri între excitația eșantionului și măsurarea semnalului emis astfel încât să fie lipsit de fluorescență parazită cu o durată scurtă de viață. Această rezoluție temporală a semnalului face posibilă îmbunătățirea raportului dintre semnalul de urmărire și zgomotul de fundal inerent condițiilor de testare, fără a fi necesară nicio etapă de separare a speciilor.

Fluorofori Dătător

În anii 1970, complexele de lantanide luminescente s-au dovedit a fi candidați interesanți ca markeri în dezvoltarea sistemelor analitice și de diagnosticare. Într-adevăr, utilizarea chelaților și criptatelor de lantanide a făcut posibilă dezvoltarea de sisteme de detectare rezolvate în timp caracterizate printr-o reducere a zgomotului de fond. Fiecare dintre aceste sonde constă dintr-un cromofor organic și o lantanidă (în principal europiu și terbiu ). Complexarea ionului de către chelat se bazează pe o interacțiune reversibilă, în timp ce în structura criptatului, cripta cușcă ionul ireversibil protejându-l de interacțiunile din mediu (stingerea fluorescenței de către moleculele de apă etc.) (Figura 4.A ). Prezența grupurilor reactive la nivelul cromoforului face posibilă grefarea complexului pe biomolecule: anticorpi, antigeni etc. O proprietate interesantă a acestor cromofori este capacitatea lor de a colecta energie de excitare (efect de antenă) și de a o transfera în cationul lantanid. Antena este necesară datorită capacității reduse de absorbție a luminii a lantanidelor, ceea ce îngreunează excitația lor directă (<fluorofori organici convenționali). Astfel, excitația complexului de lantanidă de către o lumină incidentă (laser, lampă flash etc.) contribuie la popularea nivelurilor vibraționale singlet de înaltă energie ale cromoforului (tranziția S0 → S1, S2) (Figura 4.B). Revenirea la starea de bază S0 este influențată de prezența lantanidei care favorizează trecerea intersistemului permițând popularea stărilor de triplete (T1) ale cromoforului. În cele din urmă, pasajul T1 → S0 induce un transfer de energie favorizând umplerea nivelurilor excitate de lantanidă (5D0 pentru europiu și 5D4 pentru terbiu), a cărui componentă de de-excitație radiativă este responsabilă pentru emisia luminiscentă.

Transferul de energie intramoleculară existent în cadrul acestor complexe este responsabil pentru deplasarea Stokes mare (de ordinul 200 - 250 nm ) care face posibilă depășirea interferenței datorate sursei de excitație. Această deplasare este consecința separării funcțiilor de absorbție (de către cromofor) și emisiune (de către lantanidă) în cadrul complexului. Astfel, cromoforii organici (chelat, criptat) absorb în principal în UV și în partea albastră a spectrului vizibil în timp ce lantanidele re-emit în verde - roșu: 560 nm pentru terbiu și 605 nm pentru europiu. Durata lungă de viață a acestei emisii (µs → ms) este în principal consecința tranzițiilor electronice particulare care au loc la nivelul pământurilor rare. Această caracteristică permite, de asemenea, utilizarea acestor molecule în aplicații rezolvate în timp.

În mediul biologic utilizat în mod convențional, complexul format din chelat și lantanidă poate fi disociat datorită unei stabilități reduse a interacțiunii (concurența dintre ionul lantanidă și ionii Mn 2+ , Mg 2+ , Ca 2 + sau chelarea lantanidă cu EDTA ), care este un dezavantaj. În cazul criptatelor de lantanide, includerea europiului într-o cușcă tridimensională formată din criptand previne aceste fenomene de disociere, conferind complexului o stabilitate foarte ridicată.

Criptatul de lantanidă este donatorul de energie utilizat în tehnologia HTRF (Fluorescență rezolvată în timp omogen). Dezvoltarea structurii lor provine din activitatea lui Jean-Marie Lehn , Premiul Nobel pentru chimie în 1987. Mai multe tipuri de criptat de europiu, precum și un criptat de terbiu au fost dezvoltate de compania Cisbio Bioassays. Criptatul de terbiu (Lumi4-Tb) dezvoltat recent de această companie are mai multe avantaje față de chelații de terbiu și criptatele de europiu. În primul rând, coeficientul său de extincție molară, ε = 20.000 , este de două până la trei ori mai mare decât cel al chelaților de terbiu, ε = 8.000 , iar criptatul de europiu, ε = 10.000 . În plus, spectrul său larg de absorbție face ca utilizarea Lumi4-Tb să fie compatibilă cu o gamă largă de surse de excitație: lămpi cu bliț, laser cu azot etc. Cu toate acestea, criptatele Europium rămân până în prezent punctul de referință în ceea ce privește asocierea ion / cușcă și garantează astfel testarea HTRF stabilitate foarte ridicată a semnalelor emise, în aproape toate mediile biologice. ${\ displaystyle M ^ {- 1} cm ^ {- 1}}$ ${\ displaystyle M ^ {- 1} cm ^ {- 1}}$ ${\ displaystyle M ^ {- 1} cm ^ {- 1}}$

Acceptor

Criptatele de Europiu sunt fluorofori care pot fi utilizați pentru aplicații FRET cu acceptori de energie care prezintă proprietăți spectrale în infraroșu apropiat precum Cianina 5 (Cy5). Doi acceptori de acest tip au fost dezvoltați de compania Cisbio Bioassays.

Primul acceptor dezvoltat pentru testarea HTRF este o ficobiliproteină de 105 kDa, aloficocianină purificată și modificată chimic (XL665) . Această moleculă are o foarte bună compatibilitate energetică cu criptatul, ceea ce permite o eficiență ridicată a transferului. (figura 5). În plus, emisia XL665 este maximă la 665 nm, în timp ce emisia criptatului este foarte slabă în această regiune. În cele din urmă, această moleculă are un randament cuantic bun (± 70%) și poate fi cuplată la diferite biomolecule prin grupările sale aminice.

A doua generație de acceptori este reprezentată de d2, o moleculă organică mică de aproximativ 1 kDa. La fel ca XL665, d2 este un acceptor puternic compatibil cu criptatul de europiu. Alte molecule foarte asemănătoare cu d2, cum ar fi AlexaFluor 647 sau Cy5, pot fi, de asemenea, utilizate în acest tip de test. Mărimea mică a acestor molecule reprezintă un avantaj clar pentru testele biologice, evitând în special problemele de obstacol steric.

Criptatul de terbiu, cum ar fi criptatul de europiu, poate fi utilizat cu fluorofori acceptori de energie de tip Cy5, dar are și avantajul de a putea fi asociat cu acceptori de tip fluoresceină și proteine fluorescente (GFP).

Transfer de energie: selectivitate temporală și spectrală

Sensibilitatea ridicată de detecție a tehnologiei HTRF este consecința analizei semnalului FRET rezolvat în timp (selectivitatea timpului) și a unei bune separări a spectrelor de emisie ale moleculelor donor și acceptor (selectivitate spectrală).

Selectivitatea timpului

Când se transferă energie între un donator cu o durată lungă de viață a fluorescenței și un acceptor fluorescent, acesta din urmă va emite un semnal de fluorescență având o durată de viață aparentă similară cu cea a donatorului. Astfel, utilizarea criptatelor de pământuri rare face posibilă măsurarea emisiei de fluorescență a acceptorului în timp rezolvat (integrarea semnalului după o întârziere de 50 μs pentru 350 μs) (FIG. 6.A) . Această proprietate face posibilă distingerea fluorescenței acceptorului angajat într-un FRET (durată lungă de viață) de fluorescența acceptorului liber (durată scurtă de viață ~ ns) și fluorescențe parazitare emise de biomoleculele prezente în mediul biologic. (~ Ns).

Selectivitate spectrală

Selectivitatea spectrală se obține în virtutea unei bune separări între vârful de emisie al acceptorului și vârfurile de emisie ale criptatului de europiu . Într-adevăr, acceptorul (d2, XL665) transmite într-o zonă în care criptatul nu transmite greu (Figura 6.B) .

Detectarea dublei lungimi de undă

În tehnologia HTRF, emisia de fluorescență a acceptorului la 665 nm este normalizată de cea a criptatului la 620 nm. Ambele lungimi de undă sunt măsurate simultan. Calculul raportului intensităților fluorescenței la 665 și 620 nm face posibilă evitarea variațiilor optice între diferitele medii. Prin urmare, valoarea acestui raport va depinde numai de interacțiunile biologice (Figura 6.B) . Pentru criptatul de terbiu pot fi utilizate două rapoarte. Pentru perechea Lumi4-Tb / d2, raportul 665/620 va fi ales ca mai sus, în timp ce pentru perechea Lumi4-Tb / fluoresceină, va fi raportul 520/490. Robustețea acestui semnal face posibilă, de exemplu, analiza FRET în medii biologice complexe (ser, celule etc.) sau testarea bibliotecilor ai căror compuși pot prezenta absorbanțe mari.

Exemple de aplicare

Sensibilitatea și robustețea semnalului HTRF fac din această tehnologie o abordare perfect potrivită pentru studiul interacțiunilor dintre biomolecule în sistemele de screening cu randament ridicat, practicate în industria farmaceutică. Astfel, a fost dezvoltată o mare varietate de teste care permit detectarea a numeroase evenimente biologice. Printre aceste game de produse, a fost dezvoltată o serie de kituri de testare pentru al doilea messenger pentru a măsura activarea proteinelor Gs, Gi și Gq cuplate la GPCR. Aceeași companie a înființat o nouă platformă pentru screening-ul interacțiunilor proteină-proteină la suprafața celulei. Această platformă profită de utilizarea liganzilor fluorescenți, precum și a tehnologiei SNAP-tag pentru a viza în mod specific proteinele de interes (RCPG) cu fluorofori donator / acceptor, permițând analiza interacțiunilor proteină-proteină prin FRET rezolvat în timp.

Transferul de energie intermoleculară

Tehnicile de transfer de energie, FRET (variante GFP , anticorpi marcați etc.) sau BRET , au fost utilizate pe scară largă pentru a demonstra interacțiunile proteină-proteină atât în interiorul celulei, cât și la suprafața celulei. Indiferent de metoda aleasă, această demonstrație se bazează pe detectarea unui semnal caracteristic care reflectă apropierea puternică, dacă nu asocierea, a proteinelor țintă. In domeniul receptorilor cuplați la proteinele G , aceste abordări au relevat existența receptorilor de membrană homo- sau heterodimeri și au contribuit la o mai bună înțelegere a mecanismelor implicate în timpul activării proteinelor G . De asemenea, au făcut posibilă dezvoltarea, printre altele, a sondelor sensibile la al doilea mesager, cum ar fi, de exemplu, AMPc . Într-adevăr, AMPc, prin legarea la subunitățile catalitice și de reglare a PKA, duce la o disociere a acestui complex. Astfel, prin fuzionarea fluoroforilor la nivelul diferitelor subunități, este posibil să se coreleze direct producția de AMPc intracelular cu o scădere a semnalului FRET.

Transfer de energie intramoleculară (modificări conformaționale)

Tehnicile de transfer de energie sunt abordări suficient de sensibile pentru a măsura modificările conformaționale care apar în interiorul unei proteine. Acest lucru este posibil prin încorporarea fluoroforilor donatori și acceptori în diferite poziții ale proteinei de interes. Punctele de inserție sunt alese astfel încât modificările conformaționale, modificând distanța și / sau orientarea fluoroforilor, să provoace schimbări în transferul de energie (creștere sau scădere).

Transferul de energie intramoleculară a făcut posibilă analiza modificărilor conformaționale care apar în timpul proceselor de activare a receptorilor de membrană. Astfel, Vilardaga și colab. a analizat rearanjările intracelulare induse de legarea moleculelor agoniste și antagoniste la receptorii beta-2A-adrenergici și la receptorii hormonilor paratiroidieni . Același tip de analiză a făcut posibilă studierea modificărilor conformaționale ale receptorului de androgen .

Multe sonde intracelulare au fost, de asemenea, dezvoltate pe acest principiu. Obiectivul acestor sisteme este de a putea dezvălui activarea unei anumite căi de semnalizare prin măsurarea variațiilor în concentrațiile diferiților mesageri secundari. Prima sondă fluorescentă, numită cameleon, a fost dezvoltată de Miyawaki și colab. pentru a măsura modificările concentrației de calciu din interiorul celulei (Figura 7) . După atașarea a patru ioni de calciu la domeniul său de calmodulină, sonda suferă modificări conformaționale care determină reunirea fluoroforilor. Creșterea semnalului FRET la 510 (GFP) sau 535 nm (YFP) este dependentă de producția intracelulară de calciu. Astfel este posibil să se măsoare în timp real variațiile concentrației de calciu din interiorul celulei. Au fost dezvoltate și alte sonde pentru a măsura în special concentrația de cGMP (Nikolaev și colab., 2006) sau pentru a detecta simultan activitatea PKA și a PKC.

Note și referințe

Selvin, 2000
Pentru mai multe informații despre aceste tehnici: www.arpege.cnrs.fr, secțiunea „Tehnici”
Stryer, 1978
Stryer și Haugland, 1967
Dale și colab., 1979
Sokol și colab., 1998
Chan și colab., 1979
Miyawaki și colab., 1997
Zheng și colab., 2002
Rocheville și colab., 2000
Gregan și colab., 2004
He et al., 2003
Valentin G și colab., 2005
Bastiaens și Squire, 1999
Tramier și colab., 2002
Rizzo și colab., 2004
Ormo și colab., 1996
Ward, 2006
Mathis, 1993
Trinquet și colab. 2001
Bazin și colab. 2002
Mathis, 1995
Morrison, 1988
Gabriel și colab., 2003
Trinquet și colab., 2006
Albizu și colab., 2010
Maurel și colab., 2008
Zaccolo și colab., 2000
Potrivit lui Miyawaki și colab. 1997
Vilardaga și colab. 2003
Schaufele și colab. 2005
Brumbaugh și colab., 2006

Vezi și tu

Bibliografie

(en) JR Lakowitz, Principii de spectroscopie de fluorescenta , 2 nd ediție, Kluwer Academic / Plenum publisher.