Spectrofotometru

Un spectrofotometru este un instrument pentru efectuarea unei măsurări spectrofotometrice . Un spectrometru , sau spectroscop , este un dispozitiv care face posibilă efectuarea unei măsurări spectrometrice a absorbanței unei soluții la o lungime de undă dată sau într-o anumită regiune a spectrului .

Principiu

Conform legii lui Beer-Lambert , absorbanța unei soluții este proporțională cu concentrația substanțelor în soluție, cu condiția să fie la lungimea de undă la care substanța absoarbe razele de lumină. Acesta este motivul pentru care lungimea de undă este ajustată în funcție de substanța a cărei concentrație dorim să o cunoaștem.

• Conform legii Beer-Lambert, absorbanța este o funcție a concentrației C a soluției, a coeficientului de absorbție molară și a lungimii soluției care trece prin L.LAλ{\ displaystyle A _ {\ lambda}}ελ{\ displaystyle \ varepsilon _ {\ lambda}}

LAλ=-Buturuga10⁡EuEu0=ελ⋅ℓ⋅VS{\ displaystyle A _ {\ lambda} = - \ log _ {10} {\ frac {I} {I_ {0}}} = \ varepsilon _ {\ lambda} \ cdot \ ell \ cdot C}unde este transmitanța soluției.EuEu0{\ displaystyle {\ frac {I} {I_ {0}}}}

• Rețineți că și sunt o funcție a lungimii de undă de lucru, este ales ca o funcție a spectrelor de absorbție.LAλ{\ displaystyle A _ {\ lambda}}ελ{\ displaystyle \ varepsilon _ {\ lambda}}

Aici cele două spectre sunt suprapuse, pentru a le realiza în mod independent, am măsurat absorbanța unei soluții de NAD + (respectiv de NADH, H + ) la diferite lungimi de undă (toate celelalte lucruri fiind egale).

Lungimea de undă de absorbție maximă aici este maximă = 260  nm pentru cele două molecule. Prin urmare, va fi de preferat să lucrați la această lungime de undă. Pe de altă parte, dacă vrem să analizăm NADH, H + în timpul unei reacții enzimatice în care NAD + este redus la NADH, H +, de exemplu, este mai judicios să lucrăm la = 340  nm, deoarece aici măsurăm doar NADH, H + deoarece absorbanța NAD + este zero chiar dacă este prezentă în amestec. λ{\ displaystyle \ lambda}λ{\ displaystyle \ lambda}

Spectrometrele cu infraroșu (IR) sunt utilizate în principal pentru identificare. Se poate spune că, în practică, spectrometrele UV-vizibile sunt utilizate pentru analize cantitative, în timp ce spectrometrele IR sunt instrumente calitative. Ambele folosesc principii optice similare, dar frecvența spectrometrului IR scanează eșantionul.

Galerie:

• Spectrometru de laborator (capac deschis).

• Spectrometru de laborator (închis).

• Un alt model.

• Spectrometru portabil pentru măsurarea culorii (adesea exprimată în sistemul L * a * b * ) al unei suprafețe.

Spectrometrul UV-vizibil (UV: ultraviolet) include:

• o sursă sau surse de lumină  : lumină albă pentru măsurarea spectrului vizibil ( lumină policromatică ) și / sau lumină UV.
  • Lampa UV este, în general, de tip deuteriu (interval de la 195 la 380  nm , durata de viață a lămpii de 1000  h , de exemplu).
  • Lampa vizibilă este, în general, de tip halogen (interval de la 320 la 1000  nm , durata de viață de 500  h , de exemplu).
  • Există, de asemenea, spectrometre cu lampă xenon; (interval de la 190 la 1.100  nm )
• un monocromator format dintr-o rețea care distinge lumina de sursă. Face posibilă selectarea lungimii de undă a luminii care va trece prin soluția de testat;
• un slot cu lățime fixă ​​sau variabilă pentru a regla lățimea de bandă;
• un suport de cuvă care poate permite soluția care trebuie analizată să fie menținută la temperatura dorită, această temperatură este menținută printr-un circuit de apă sau un efect Peltier . Această menținere la o temperatură fixă ​​este foarte utilă în măsurătorile cineticii enzimatice , de fapt, viteza de reacție depinde de temperatură;
• o cuvă transparentă în care este plasată soluția de studiat. În funcție de calitatea și cantitatea probei, există diferite cuve, în general din plastic (spectru vizibil, aproape de UV) sau cuarț (UV, dar cuve foarte scumpe).

Solventul și reactivul utilizat (e) nu sunt întotdeauna transparente, este obligatoriu să efectueze un „gol“ sau a unui indicator de compensare, adică o reducere la zero a dispozitivului (tara), prin plasarea numai solventul și reactivul ( s) utilizate în cuvă, înainte de măsurarea cuvei care conține proba, pentru fiecare lungime de undă studiată.
Proiectele de cercetare sunt în general cu două fascicule și utilizează două cuve, cuva de referință conținând solventul și reactivul (reactivii) și cuva conținând proba (cu solvent și reactiv (i)). Lichidul din cuva de referință este apoi scăzut automat (funcție de zero automat);

• o celulă fotoelectrică , restabilind un curent proporțional cu numărul de fotoni primiți. La modelele recente, detectorul de tip fotodiodă unic este uneori înlocuit cu o matrice CCD sau o matrice de diode (fiecare celulă sensibilă primește o culoare fixă). Cele mai sensibile modele utilizează un detector de tip fotomultiplicator sau PMT;
• un detector electronic al cărui răspuns este proporțional cu acest curent electric și permite o măsurare relativă a intensității luminii.

Spectrometria este utilizat în principal pentru a determina concentrația unei soluții de colorant (proces numit test colorimetric ).

Domenii de aplicare

În biologie

• Spectrometrul este utilizat la efectuarea testului MTT .
• În biologia moleculară , este utilizat în timpul extracției ADN , pentru a cuantifica ADN-ul și a determina puritatea acestuia. Se utilizează lungimea de undă 260  nm, care este aria de absorbție maximă a acizilor nucleici. O a doua măsurare la 280  nm face posibilă verificarea purității extracției, și anume prezența proteinelor reziduale în soluția de ADN.

Pentru o soluție de ADN purificat, raportul R ar trebui să fie între 1,8 și 2. Dacă R este semnificativ mai mic de 1,8, atunci proteinele contaminează probabil soluția. Mai mare de 2, acest raport indică o contaminare probabilă de către ARN.

R = (A 260 - A 320 ) / (A 280 - A 320 ) R este simplificat atunci când (caz frecvent) A 320 = 0.

Concentrația ADN poate fi calculată din măsurarea la 260  nm folosind un factor de corelație:

• ADN dublu catenar: 1 Abs = 50 ng / pl
• ADN monocatenar: 33 ng / µl (cum ar fi ARN monocatenar)
• ARN: 1 Abs = 40 ng / pl.

În biochimie , este utilizat în timpul purificării proteinelor, pentru a le cuantifica (lungimea de undă 280  nm ) și pentru a determina nivelul lor de puritate (lungimea de undă 260  nm ).

În medicină

Analiza cinetică a diferitelor enzime din sânge, determinarea fosfatazei alcaline: colestază, lactat dehidrogenază: infarct miocardic, hemoliză.

În fizică

Analiza luminii face posibilă determinarea componentelor chimice la originea emisiilor de lumină: de exemplu, compoziția chimică a stelelor.

În chimie

Analiza absorbției soluțiilor la o anumită lungime de undă permite dozarea acestor soluții conform legii Beer-Lambert (concentrația este proporțională cu logaritmul absorbției luminii). Prin urmare, există o relație directă între cantitatea de lumină absorbită și concentrația compusului chimic din soluție. Monitorizarea absorbției în timp este o metodă de caracterizare a vitezei reacțiilor chimice (cinetică).

O măturare a frecvenței face posibilă caracterizarea speciilor prezente în soluție revenind la natura tranziției energetice luate în considerare.

În artele grafice

Se utilizează pentru a măsura culorile pentru a calibra dispozitivele de ieșire, cum ar fi plotterele .

Bibliografie

• Georges Bruhat , Optique , ediția a șasea, colecția de cursuri de referință, Dunod, 2005, 1152 p.

Vezi și tu

• Spectrofotometrie
• spectrometrie

Note și referințe

1. Cf. G. Bruhat (2005), Optică , ediția a șasea, Dunod: § Spectrofotometrie.
2. Prin omogenitate cu unitatea utilizată în general pentru coeficientul de absorbție molară, lungimea este exprimată în cm. Acesta este motivul pentru care majoritatea cuvetelor sunt standardizate la L = 1  cm .