Mutageneza este inducerea uneia sau mai multor mutații într - un genom , cu precizie si in mod voluntar. Această metodă este utilizată pentru a modifica structurile ADN , ARN și proteine . Această tehnică de biologie moleculară a fost dezvoltată de Michael Smith în 1978. Aparent, ideea mutagenezei direcționate la fața locului i-a apărut în timpul unei conversații cu Clyde Hutchison în 1976 la Cambridge Institute din Anglia, când „lucra la pregătirea oligonucleotide pentru purificarea fragmentelor de ADN. Această descoperire majoră i-a adus premiul Nobel pentru chimie în 1993 alături de Karry Mullis , inventatorul reacției în lanț a polimerazelor .
Metodele de mutageneză direcționate către sit se bazează pe reacția în lanț a polimerazei (PCR). Mutațiile sunt introduse folosind primerii oligonucleotidici care sunt sintetizați în prealabil. Acești primeri sunt complementari cu secvența de tip sălbatic, cu excepția nucleotidelor care trebuie mutate. Într-adevăr, PCR nu necesită o complementaritate strictă între primerul nucleotidic și secvența ADN țintă. La sfârșitul reacției PCR, mutațiile sunt introduse în produse și pot fi de trei tipuri:
1) Substituții: una sau mai multe nucleotide sunt înlocuite cu același număr de nucleotide diferite.
2) Inserții: una sau mai multe nucleotide sunt adăugate la secvența țintă.
3) Ștergeri: una sau mai multe nucleotide sunt eliminate din secvență.
Una dintre primele abordări ale mutagenezei direcționate către sit se bazează pe extensia de suprapunere. Primerii complementari sunt utilizați pentru a genera fragmente de ADN cu capete suprapuse prin PCR. Aceste fragmente sunt combinate, iar hibridizarea lor permite alungirea regiunii suprapuse. Mutațiile sunt introduse într-un mod specific prin schimbări de nucleotide în secvența primerilor.
În practică, două perechi de primer sunt utilizate pentru a efectua trei reacții PCR. Grundele 1 și 2 poartă mutația în regiunea lor 5 'și sunt complementare una cu cealaltă. Grundele 3 și 4 delimitează ADN-ul țintă de amplificat. Primul PCR se efectuează cu primerii 2 și 3 și face posibilă amplificarea părții stângi a ADN-ului țintă, inclusiv regiunea mutantă. A doua PCR, efectuată cu primeri 1 și 4, produce partea dreaptă a ADN-ului țintă, inclusiv regiunea mutantă. Purificate, amestecate și denaturate, produsele acestor două PCR se pot hibridiza cu regiunea mutantă care le este comună. O a treia PCR cu oligonucleotidele 3 și 4 face posibilă obținerea ADN-ului țintă complet cu mutația.
Alte abordări importante includ mutageneza direcționată către site-ul vectorului QuickChange.
Sunt posibile multe tehnici, prin PCR :